Лабораторная диагностика стафилококковых и стрептококковых инфекций Лабораторная диагностика стафилококковых болезней

Стафилококки (Staphylococcus aureus) относят к гноерод­ным микробам. Они вызывают гнойные поражения кожи, подкожной клетчатки, слизистых оболочек, а также более глубоких тканей, тяжелые послеродовые септицемии, по­слеоперационные нагноения, пищевые интоксикации, вто­ричные инфекции при некоторых инфекционных заболева­ниях, а у детей — сепсис, тяжелые пневмонии и перепонча­тые колиты.

При заболеваниях, вызванных стафилококками, иссле­дуют гной, отделяемое слизистых оболочек, кровь, мокроту и мочу, в случае пищевых отравлений — рвотные массы, ис­пражнения больных, остатки пищи.

Из открытых гнойных поражений материал берут ватным тампоном, после удаления верхнего слоя гноя, в котором могут находиться непатогенные стафилококки — обычные обитатели кожи и воздуха. При наличии закрытых гнойных очагов делают пункцию и гной из шприца выливают в сте­рильную пробирку. Отделяемое слизистых оболочек снима­ют тампоном. Мочу, мокроту собирают в стерильные про­бирки и банки. Кровь в количестве 5—10 мл, взятую шпри­цем из локтевой вены с соблюдением правил асептики, сеют у постели больного во флакон, содержащий 100—200 мл са­харного бульона (рН 7,2—7,4). Стафилококки хорошо раз­виваются и на простых средах, однако, используют сахарный бульон, так как септицемия может быть вызвана не только стафилококками, но и другими более требовательными к пи­тательным средам микроорганизмам: стрептококками, пнев­мококками.

Бактериоскопическое исследование. Все объекты, подлежащие изучению, за исключением крови, микроскопируют. Мазки делают тампоном или петлей, гной

179

густой консистенции вносят в каплю стерильной воды и ок­рашивают по Граму. Стафилококки располагаются неболь­шими скоплениями попарно, короткими цепочками, окраши­ваются они грамположительно (см. рис. 12, 1). По располо­жению и тинкториальным свойствам довольно трудно дифференцировать стафилококки и стрептококки, поэтому, не ограничиваясь микроскопией, производят посев исследуемо­го материала.

Бактериологическое исследование. В 1-й день исследования гной, отделяемое слизистой оболочки зе­ва, мокроту, осадок мочи после центрифугирования сеют в чашки с 3—5% кровяным агаром. Посев делают петлей или шпателем таким образом, чтобы получить отдельные коло­нии, чашки помещают в термостат при 37° на 18—24 часа.

На 2-й день исследования изучают колонии. Стафилокок­ки образуют средней величины, выпуклые, непрозрачные колонии гомогенной или мелкозернистой структуры. Пато­генные штаммы на кровяном агаре образуют вокруг коло­ний зону гемолиза. В мазках при микроскопии обнаружи­вают типичные грамположительные стафилококки, распо­лагающиеся в виде гроздей винограда. На основании данных о морфологических и культуральных свойствах мож­но дать предварительное заключение об обнаружении ста­филококка.

Дальнейшее исследование направлено на выделение чис­той культуры стафилококка, для чего колонии пересевают на скошенный агар, а остаток на молочный агар (к мясо-пептонному агару добавляют 10% снятого стерильного мо­лока) для выявления пигмента. Посевы помещают в тер­мостат при 37°. На 3-й день исследования учитывают образо­вание на молочном агаре пигмента, который может быть зо­лотистым, белым, лимонно-желтым. Затем проверяют спо­собность выделенной культуры коагулировать плазму и вы­зывать некроз.

Для выявления плазмокоагулазы культуру сеют в про­бирку с цитратной плазмой (10 мл крови, взятой из сердца кролика, наливают в пробирку с 1 мл 5% раствора лимон­нокислого натрия. После центрифугирования или отстаива­ния отделяют плазму, разводят ее изотоническим раствором 1 : 4 и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл). Посевы помещают в термостат при 37°, наблюдают за ними и от­мечают время появления коагуляции — свертывания плаз­мы. Из этой же культуры готовят 2-миллиардную взвесь и вводят 0,2 мл внутрикожно кролику светлой масти.

180

Патогенные стафилококки на 5% кровяном агаре обра­зуют широкую зону гемолиза вокруг колоний, коагулируют плазму в течение 2 часов и вызывают некроз при внутри-кожном введении кролику.

Условно патогенные стафилококки на кровяном агаре да­ют незначительный гемолиз, коагулируют плазму в течение 6 часов и при внутрикожном введении вызывают появле­ние инфильтрата или гиперемии (без некроза).

Непатогенные стафилококки не дают гемолиза, не коагу­лируют плазму или свертывают ее после 10 часов и при внутрикожном введении кролику не вызывают реакции.

Для быстрой дифференциации патогенных и непатоген­ных стафилококков используют среду Чепмена. К 1 л 3,5% мясо-пептонного агара прибавляют 3,3 мл 0,1% водного раствора кристаллического фиолетового. На этой среде патогенные стафилококки развиваются в виде фиолетовых или оранжевых колоний. Рост непатогенных стафилококков подавляется анилиновым красителем.

Выявление гиалуронидазы, фибринолизина, других фер­ментов агрессии, а также способности расщеплять маннит используют для дифференциации Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis; последний является обычным обитателем кожи и может находиться в гное при поражени­ях различной этиологии. Непатогенный стафилококк (Sta­phylococcus epidermidis) чаще не продуцирует гиалуронида-зу и фибринолизин.

Одним из новых методов дифференцирования патогенных стафилококков является применение типовых фагов. Осо­бое значение имеет определение фаготипов в выявлении ис­точника заболевания.

Основной набор стафилококковых фагов состоит из 21 типа. Методи­ка типирования стафилококков заключается в следующем. В чашку с мясо-пептонным агаром сеют 4—6-часовую бульонную культуру для по­лучения равномерного роста, поверхность агара заливают 1 мл культу­ры, избыток отсасывают пастеровской пипеткой и подсушивают чашку в термостате 30 минут. На дне чашки рисуют сетку с количеством квад­ратов, равным числу типовых фагов и контролей. В каждый квадрат вносят небольшую каплю фага, разведенного до критического тест-разве­дения (наибольшее разведение фага, которое дает сливной лизис соот­ветствующего штамма). После подсушивания чашки помещают в термо­стат на 5—6 часов при 37°, затем оставляют при комнатной температу­ре в течение 12 часов. Фаготип стафилококка обозначают наименовани­ем фага, который вызвал его полный лизис. Однако один штамм стафи­лококка может лизироваться несколькими типами фагов, поэтому все типовые фаги и штаммы патогенных стафилококков объединены в 4 группы.

181

В последнее время обязательным является определение чувствительности выделенных стафилококков к антибиоти­кам для выявления лекарственночувствительных и лекарст-венноустойчивых штаммов (см. стр. 118).

Для выделения гемокультуры посев крови в сахарном бульоне выдерживают в течение 18—24 часов в термостате при 37°. Стафилококк вызывает равномерное помутнение среды. Из гемокультуры (2-й день исследования) готовят мазки, затем делают пересев в чашку с кровяным агаром для выявления гемолитической способности и на скошенный мясо-пептонный агар. Культуру стафилококка, полученную на скошенном агаре (3-й день исследования), изучают так же, как культуру, выделенную из гноя или других мате­риалов.

При пищевых отравлениях исследуемый материал микро­скопируют, после чего сеют в 2 чашки с мясо-пептонным ага­ром и для обогащения в бульон с 1% глюкозы. Материал, загрязненный посторонними микробами, сеют на кровяной агар с 6—7% поваренной соли. На последней среде хорошо растут и проявляют гемолитическое действие стафилококки ¹ (они могут развиваться в присутствии 12% соли и 50% са­хара), а рост кишечных и спороносных бактерий задержи­вается. В этих условиях бактерии протея не дают сплошного роста в виде пленки.

Посевы помещают в термостат при 37°. На следующий день изучают колонии, выделяют чистые культуры стафило­кокков и идентифицируют их: определяют пигмент, фермен­тативные свойства и токсинообразование. Патогенные ста­филококки, вызывающие пищевые отравления, образуют зо­лотистый, реже белый пигмент, разжижают желатину, вызывают гемолиз и коагулируют плазму.

Для установления продукции энтеротоксина культуру ста­филококка сеют на 1% мясо-пептонный агар. Посевы поме­щают в эксикатор с 20% С0₂ и инкубируют при 37°. Затем экстрагируют токсин: в чашку наливают 10 мл изотониче­ского раствора, шпателем измельчают агар, оставляют на 2 часз, после чего экстракт центрифугируют. Верхний про­зрачный слой, содержащий токсин, отделяют и проверяют его гемолитическую активность. Для этого к токсину, разве­денному от 1 : 40 до 1 : 2560, добавляют равные объемы 2% взвеси отмытых эритроцитов кролика и помещают в термо­стат. Предварительный учет производят через 2 часа, а окончательный — через сутки. Энтеротоксин вызывает ге­молиз в разведении 1 : 160 и выше. Однако это испытание

182

Материалом для исследования являются гной, кровь, отделяемое слизистых оболочек, моча, мокрота. Берут его так же, как при заболеваниях, вызванных стафилокок­ками.

Бактериоскопическое исследование. В маз­ках из гноя, отделяемого слизистых оболочек, окрашенных по Граму, стрептококки располагаются короткими цепочка­ми (рис. 78), а иногда в виде диплококков или единичных кокков, в последнем случае стрептококки нельзя отличить от стафилококков, поэтому производят посев для изучения других свойств обнаруженных кокков.

Бактериологическое исследование. Гной, отделяемое слизистой оболочки, мочу, мокроту сеют в чаш­ку Петри с 5% кровяным агаром и в пробирку с сахарным бульоном. На следующий день после инкубации в термоста­те при 37° изучают колонии и рост в сахарном бульоне. Streptococcus pyogenes образует мелкие, плоские, сухова­тые колонии зернистой структуры.

Стрептококки, продуцирующие |3-гемотоксин (стрепто-лизин),*образуют вокруг колоний зону гемолиза, у выделяю­щих а-гемотоксин появляется зона позеленения вследствие образования метгемоглобина. В случае отсутствия гемоток-сина гемолиз не наблюдается. В сахарном бульоне стреп­тококки дают придонный или пристеночный рост в виде хлопьев или зерен, а вся среда остается прозрачной.

В мазках из колоний стрептококков не отмечается типич­ного расположения кокков в виде цепочек. Клетки распола­гаются одиночно, попарно или небольшими скоплениями. В мазке из культуры в жидкой среде обнаруживают типич­ные цепочки стрептококков.

На основании полученных данных можно выдать ре­зультат исследования: «Выделен Streptococcus pyogenes». Однако исследование на этом этапе не заканчивают, в дальнейшем определяют группы, а также типы стрепто­кокка.

Группы стрептококка (по Лэнсфильд) классифицируют по наличию полисахаридного антигена, который извлекают и определяют посредством преципитации с групповыми сыво­ротками, обозначаемыми большими буквами латинского ал­фавита А, В, С, и т. д.

Типы стрептококков по Гриффитсу характеризуются при­сутствием специфического протеинового антигена, который определяют реакцией агглютинации на стекле с типовыми агглютинирующими сыворотками. Для этой цели суточную

184

гемолитической способности служит косвенным доказатель­ством присутствия энтеротоксина. Более достоверной яв­ляется биологическая проба. Котятам 1— 2¹/₂ месяцев вво­дят в желудок посредством зонда 10—15 мл полученного токсина или экстракта исследуемого продукта. При нали­чии энтеротоксина через 30—60 минут у котят наступает рво­та— основной признак отравления, иногда наблюдается по­нос, в редких случаях летальный исход.

Экстракт можно вводить котятам внутрибрюшинно, пред­варительно прогрев его при 100° в течение 30 минут для инактивации термолабильных фракций токсина. В настоя­щее время токсигенность выделенных культур стафилокок­ка определяют в опыте in vitro диффузионной преципита­цией в агаре (см. стр. 145). Антитоксическую сыворотку для этой реакции используют неразведенной.

Патогенные стафилококки могут находиться в воздухе операционных, перевязочных, родильных палат и других больничных помещений. Для обнаружения их делают по- севы по методике, изложенной на стр. 102. Хорошие резуль- таты дает применение мясо-пептонного желточно-солевого агара. Стафилококки, выделяющие лецитиназу, образуют вокруг колоний зоны помутнения, что облегчает выделе- ние их.

Мясо-пептонный желт очно-со левой агар

К 100 мл расплавленного мясо-пептонного агара с 7,5 г хлористого натрия прибавляют 20 мл стерильной желточной взвеси, перемешивают и разливают в чашки.

Желточная взвесь: желток куриного яйца извлекают асептически, отмывают от белка, помещают во флакон с бусами, добавляют 200 мл изотонического раствора хлористого натрия и встряхивают до полного смешивания. Взвесь сохраняют в холодильнике.

Оценка чистоты воздуха изложена на стр. 104.