Задания

1. Приготовление всех ингредиентов реакции гемолиза.

2. Постановка опыта титрования комплемента.

3. Демонстрация лизиса лептоспир в темном поле зре- ния.

Реакция связывания комплемента

В реакции связывания комплемента участвуют 5 ингреди­ентов: антиген, антитело и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая си­стема). Специфическое взаимодействие антигена и антитела

163

сопровождается адсорбцией комплемента. При ультрамик­роскопической величине антигена эта реакция не поддает­ся наблюдению. Борде и Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему, которая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом анти­ген — антитело или нет. Если комплемент связан этим комп­лексом, гемолиз не произойдет (рис. 76, а). Если комплекса антиген — антитело не образовалось, комплемент не фикси­ровался первой системой, он соединяется со второй систе­мой и вызывает гемолиз (рис. 76, б). Эта реакция получи­ла название реакции связывания комплемента (РСК).

Реакция связывания комплемента является весьма чув­ствительной и специфической, поэтому, несмотря на ее сложность, она применяется в диагностике многих инфек­ционных болезней. Реакция связывания комплемента мо­жет быть использована для выявления специфических ан­тител по известному антигену, а также с целью выявления антигена по известным антителам. С помощью ее обнару­живают комплементсвязывающие антитела в сыворотке крови у больных сапом, хронической гонореей, риккетсио-зами, вирусными болезнями. При сифилисе РСК исполь­зуют в виде реакции Вассермана, которая отличается от классической реакции связывания комплемента (реакции Борде — Жангу).

Постановка основного опыта реакции связывания комп­лемента требует особой подготовки. Посуду (пробирки, пи­петки, флаконы) тщательно моют и не используют в других целях. Все ингредиенты реакции подготавливают и тит­руют до постановки опыта.

Сыворотка больного. Кровь обследуемого берут натощак, накануне взятия крови больным запрещается упо­треблять спиртные напитки, жирную и острую пищу. За день до постановки опыта для устранения комплемента сы­воротку инактивируют прогреванием в водяной бане при температуре 56° в течение 30 минут. В день постановки ре­акции сыворотку разводят 1:5, 1 : 10 и выше. Титр этой ре­акции редко превышает 1 : 320.

Антиген изготовляют производственные институты. В ре­акции связывания комплемента применяются антигены из взвесей убитых бактерий, их лизатов, диализованных мик­робных полисахаридов, полных антигенов, экстрактов тка­ней, содержащих микробы, экстрактов тканевых липидов.

Титр антигена определяется его количеством в миллилитрах, которое дает полную задержку гемолиза со

164

специфическими сыворотками. Его обозначают на этикетке ампулы.

Все микробные антигены адсорбируют какое-то количе­ство комплемента, поэтому перед титрованием их проверяют на антикомплементарные свойства, определяют так назы­ваемую растворяющую дозу антигена, т. е. то наибольшее количество антигена, которое не вызывает задержки гемо­лиза. Для определения титра антигена используют 7г и ²/з растворяющей дозы антигена.

Перед постановкой реакции антиген разводят изотониче­ским раствором хлористого натрия таким образом, чтобы в 1 мл находилась доза, равная титру. Например, титр антигена равен 0,04 мл. Для разведения берут 0,04 мл ан­тигена и 0,96 мл изотонического раствора. Так как все ингредиенты реакции вводятся в объеме 0,5 мл, следова­тельно, количество антигена в реакции будет равным по­ловине титра (рабочая доза). Все остальные компоненты реакции подготавливают так же, как для реакции гемолиза.

Таблица 12

Схема основного опыта реакции связывания комплемента

Первая система				Вторая система
пробирка ингредиенты (в мл)	1-я опыт­ная	2-я конт­роль сыво­ротки	3-я конт­роль анти­гена	^""^^ пробирка ингредиенты (в мл) \	4-я
Исследуемая сыво­ротка, разведенная 1 :5 Антиген в рабочей дозе	0,5 0,5	0,5	0,5	Гемолитическая сы­воротка в тройном титре 3% взвесь эритроци­тов барана	2 2
Комплемент в рабо­чей дозе 0.85% раствор NaCl	0,5	0,5 0,5	0,5 0,5	Пробирки ставят в стат при 37° на 30	термо­минут

Пробирки ставят в термостат при 37° на час

Постановка основного опыта РСК. Как видно из табл. 12, в 1-ю пробирку наливают сыворотку, антиген и комплемент, во 2-ю пробирку — сыворотку, компле­мент и вместо антигена 0,85% раствор NaCl (контроль сыворотки), в 3-ю пробирку — антиген, комплемент и вме­сто сыворотки 0,85% раствор NaCl (контроль антигена).

165

Все 3 пробирки первой системы ставят в термостат на 1 час, затем в каждую из них добавляют по 1 мл второй системы (смесь эритроцитов и гемолитической сыворотки), которую предварительно выдерживают в термостате 30 ми­нут. После тщательного смешивания ингредиентов пробир­ки ставят в термостат при 37° на час. Результат учитывают предварительно после извлечения из термостата и оконча­тельно после пребывания в течение 15—18 часов в холо­дильнике.

При окончательном учете интенсивность реакции отме­чают плюсами: ++ + + резко положительная реакция, ха­рактеризующаяся полной задержкой гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты оседают на дно; + + +, ++ положительная реакция отличается нараста­нием окраски жидкости вследствие гемолиза и уменьшени­ем количества эритроцитов в осадке; + слабо положитель­ная реакция, жидкость окрашена интенсивно и на дне про­бирки незначительное количество эритроцитов. Отрицатель­ная реакция отмечается знаком —, при этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно ро­зовую (лаковую) окраску.

Обычно используют несколько антигенов (различные се­рии). В качестве контроля ставят реакцию с заведомо от­рицательной и заведомо положительной сыворотками.

В пробирки первой системы прибавляют по 1 мл второй системы и ставят на час в термостат.

При использовании РСК для диагностики вирусных бо­лезней и риккетсиозов наряду с обычной рабочей дозой комплемента ставят дополнительно реакцию с полуторной и двойной дозой его.

Реакция связывания комплемента на холоде широко при­меняется в диагностике вирусных болезней. Ее используют для определения антител при наличии известного специ­фического антигена и неизвестного антигена в присутствии известной сыворотки. Этим методом выявляют вирус в за­раженных куриных эмбрионах, организме животных и куль­туре ткани. Антигенами в реакции связывания комплемента являются взвеси различных инфицированных тканей жи­вотного, эмбриональные и другие культуры, от больного человека — кровь, спинномозговая жидкость, моча, фека­лии. Они должны быть достаточно концентрированы и спе­циально обработаны для устранения антикомплементарных свойств. Антигены из высоковирулентных вирусов инакти-вируют добавлением слабых концентраций формалина

166

(1 :500— 1 : 1000) или ультрафиолетовым облучением. При постановке реакции применяются дополнительные контро-ли с антигенами из нормальной ткани. Первую систему (сыворотка, антиген и комплемент) выдерживают не в тер­мостате, а на холоде при 3—5° в течение 18 часов. После добавления гемолитической системы пробирки помещают в термостат. Этот метод повышает специфичность и чувстви­тельность реакции.

Антитела, связывающие комплемент, появляются уже в первые дни вирусных болезней, что позволяет использо^-вать реакцию связывания комплемента как более ранний метод их диагностики. Однако эти антитела обычно на­капливаются до высокого титра в период выздоровления. Поэтому наиболее достоверными являются данные при ис­следовании парных сывороток, взятых в начале заболева­ния и в период реконвалесценции.

Задания

1. Постановка основного опыта реакции связывания ком- племента.

2. Предварительный учет реакции.

3. Демонстрация положительной РСК различной интен- сивности.