Реакция лизиса и гемолиза

Лизис представляет собой сложную реакцию, в кото­рой участвуют три компонента: антиген (микробные клетки, эритроциты), антитело (лизин) и комплемент, содержащий­ся в сыворотке крови животных. Антитела обладают отно­сительной термостабильностью, они не разрушаются от на­гревания при 60° в течение нескольких часов. Антитела, вы­зывающие лизис бактерий, называются бактериолизинами, а антитела, вызывающие лизис эритроцитов, — гемолизи­нами. Комплемент термолабилен. Он полностью инактиви-руется при 56° в течение 30 минут.

За исключением холерного вибриона и трепонем, боль­шинство микробов проявляет устойчивость к литическому действию антител. Поэтому реакция лизиса не нашла ши­рокого применения в лабораторной практике. Она исполь­зуется для диагностики холеры и называется феноменом Исаева — Пфейффера.

Феномен Исаева — Пфейффера проводят на двух морских свинках. Первой (подопытной) вводят внутрибрю-шинно смесь, состоящую из 1 мл мясо-пептонного бульона, одной петли исследуемой культуры вибриона на плотной питательной среде и 0,2 мл холерной сыворотки, разведен­ной 1 : 100. Второй (контрольной) вводят смесь, содержа­щую 1 мл бульона, 1 петлю испытуемой культуры и 0,2 мл нормальной сыворотки. Через каждые 20 минут в течение

159

часа у животных берут йерйтоНеаЛьную жидкость. Для этого в нижней части живота делают прокол кожи тол­стой иглой или надрезают ее скальпелем. В место проко­ла или надреза вводят капилляр пастеровской пипетки и пробивают им мышечную стенку, перитонеальная жидкость поднимается по капилляру пипетки. Из этой жидкости делают мазки и препараты «висячей» капли. Если изу­чаемый вибрион является холерным, то в препаратах, полученных от подопытной свинки, наблюдаются следующие изменения: сначала у вибрионов прекращается подвиж­ность, затем появляются овальные клетки, потом шары и, наконец, наступает растворение их. Морфологические изме­нения и лизис происходят в течение часа, реже — 2 часов. У контрольной свинки вибрионы не изменяются, сохраняют подвижность, количество их может увеличиться. В даль­нейшем контрольное животное погибает, а подопытное ос­тается живым.

Реакцию гемолиза используют в качестве индика­тора в реакции связывания комплемента. В некоторых слу­чаях ее ставят для определения количества комплемента в сыворотке крови с целью выявления иммунобиологического состояния больного.

Для постановки реакции гемолиза необходимо иметь: 1) эритроциты барана, 2) гемолитическую сыворотку, содер­жащую гемолизины к бараньим эритроцитам, и 3) компле­мент.

Про­бирка	Гемолитичес­кая сыворотка в разведении	3% взвесь эритро­цитов (в мл)	Комп­лемент в раз-веде­нии 1 : 10	0,85% раствор NaCl (в мл)	Экспозиция	Результат
1-Я	0,5(1 : 1 200)	0,5	0,5	1	Пробирки ста-	Гемолиз
2-я	0,5(1:1 500)	0,5	0,5	1	вят в термо-
3-я	0,5(1 : 1 800)	0,5	0,5	1	стат при 37°	»
4-я	0,5(1:2 000)	0,5	0,5	1	на час	Частичный ге-
						молиз
5-я	0,5(1:2 500)	0,5	0,5	1		То же
Кон­троль 6-я	—	0,5	—	2		Отсутствие ге­молиза

Р
еакция гемолиза протекает в две фазы. В первой фазе происходит взаимодействие между эритроцитами и гемоли­тической сывороткой, в результате чего эритроциты сенси­билизируются. Во второй фазе сенсибилизированные эри­троциты фиксируют комплемент и наступает гемолиз. Эта реакция представляет собой не гемолиз, а гемоглобинолиз, так как она сопровождается нарушением связи между обо­лочками эритроцитов и гемоглобином. Последний легко про­никает из эритроцитов в окружающую среду. Истинный же гемолиз наступает в результате воздействия на эритроциты гипотонического раствора, под влиянием которого оболочки вначале растягиваются, а затем разрываются, что приводит к выходу свободного гемоглобина из эритроцитов.

Реакция гемолиза протекает при обязательном условии строгого количественного соотношения всех ингредиентов, поэтому постановке реакции предшествует подготовка их.

Взвесь эритроцитов готовят накануне постановки опыта. Кровь у барана берут из яремной вены. Ее собирают во

160

флакон с бусами и дефибринируют встряхиванием в тече­ние 10—15 минут. Эритроциты отмывают в изотоническом растворе центрифугированием. Последняя порция промыв­ной жидкости должна быть совершенно бесцветной. Для получения 3% взвеси эритроцитов 1 мл осадка вносят в 33 мл изотонического раствора.

Гемолитическую сыворотку изготовляют в производствен­ных институтах и на биофабриках. Для этой цели имму­низируют кроликов путем 3—4-кратного внутривенного вве­дения^ 2—5 мл 50% взвеси бараньих эритроцитов. Через 6 дней после последней инъекции делают пробное кровопу­скание, определяют титр сыворотки по специальной схеме (табл. 10). Если он достаточно высок, производят массив­ное кровопускание.

Титром гемолитической сыворотки называют ее макси­мальное разведение, которое обеспечивает полный гемолиз в присутствии комплемента при температуре 37° в течение часа. Титр гемолитической сыворотки должен быть не ни­же 1 : 1200. Для реакции гемолиза берут гемолитическую сыворотку в тройном титре, т. е. в тройном количестве.

Комплемент содержится в любой свежей сыворотке. Обычно используют сыворотку морской свинки, у которой кровь берут из сердца накануне опыта. Учитывая, что со­держание комплемента зависит от физиологического состоя­ния, возраста и питания животных, кровь берут у 3—4 сви­нок. После свертывания крови сыворотку отделяют, разво­дят 1 : 10 или 1 : 20 изотоническим раствором NaCl и тит­руют.

162

ца 11		□ль	12-я	1*				BSHFOIM3J | эияхэ -xAcwlq
к		(X				•
Т а б л		Кон-	11-я	©		0,5 взвеси эритро цитов		всигогоэл эияхэ -xAdxq
		10-я		Ю О				£HIfON9J
				0,45 1,05				£HIfOPM3J
		(Я со						£HIfOIM9J
	а	г 1		0,35 1,15				SHIT0W9J
	я комплемент	« СО		СО (М о ^		г-		SHIT0K9J
		«		0,25 1,25				SHIfOP\I9J
	Схема титровани			<м со				СИ1Г01М -9J И1ЧН -иихэв^
		сб		0,15 1,35	инут			BGHiroiM9J эияхэ -хуСэхо
		2-я		о"—Г	эи 37° на 45 м		ГН\7Т шу 1	веи1Г01М9х ЭИЯХЭ -хАэхо
		к		0,05 1,45			a ovj IV! х	веикомэл ЭИЯХЭ -хАэхо
		Пробирка	Ингреди^н^тьт^в"^ *" --«^^	Комплемент в разведении 1 : 10 0,85% раствор NaCl	Пробирки ставят в термостат п]	Гемолитическая система	Пробирки ставят в термостат н.	Результат

Титром комплемента является его наименьшее количест­во, которое в присутствии гемолитической сыворотки, взя­той в тройном титре, вызывает полный гемолиз в течение 30 минут при 37°. Все компоненты входят в объеме 2,5 мл. Эритроциты барана используют в виде 3% взвеси (табл. 11).

Как видно из табл. 11, титр комплемента равен 0,25 мл. В опыт вводят рабочую дозу комплемента, которая выше титра сыворотки на 25%, т. е. 0,3 мл. Рабочая доза должна находиться в объеме 0,5 мл. Следовательно, к 0,3 мл сы­воротки, разведенной 1 : 10, добавляют 0,2 мл изотоническо­го раствора.

Опыт титрования сопровождается двумя контролями: в 11-й пробирке находятся эритроциты, не сенсибилизиро­ванные гемолитической сывороткой, и комплемент, в 12-й пробирке — сенсибилизированные эритроциты без компле­мента. В этих двух пробирках гемолиза не наступает.

В тех случаях, когда нет возможности получить свежий комплемент, пользуются консервированным, активность ко­торого при хранении в холодильнике не изменяется в тече­ние 1—2 месяцев. Для консервирования к сыворотке крови морской свинки, взятой накануне, добавляют 4% химиче­ски чистой борной кислоты и 5% химически чистого серно­кислого натрия. Титрование консервированного комплемен­та производится так же, как нативного, в день постановки опыта. Производственные институты готовят сухой компле­мент, срок годности которого равен 3—4 годам.

Как уже говорилось, титр комплемента определяют в сыворотке людей для изучения иммунологического состоя­ния организма. Методика титрования комплемента (табл. 11) в крови человека аналогична опыту титрования комплемента в сыворотке морской свинки.