Задания

1. Приготовление антигена (экстракта) для реакции пре­ципитации.

2. Постановка реакции кольцепреципитации для обнару­жения природы антигена.

3. Изучение различных преципитирующих сывороток.

Реакции агглютинации

Агглютинацией называется склеивание микробов или дру­гих клеток при воздействии на них специфических антител в присутствии электролита. Для постановки реакции агглю­тинации необходимо наличие трех компонентов: 1) антиге­на (агглютиноген), 2) антитела (агглютинин) и 3) электро­лита (изотонический раствор NaCl). Такая реакция назы­вается специфической.

К неспецифическим относится спонтанная и кислотная агглютинации. Спонтанная агглютинация наблюдается у R-вариантов микробов. Они не образуют гомогенной взвеси в 0,85% растворе поваренной соли, а осаждаются в виде клеточных агрегатов. Кислотная агглютинация наступает в результате воздействия на взвесь микробов кислот, которые снимают одноименный заряд на поверхности микробных

147

бок, укрепленных Ма Штативе под углом; сверху в месте соё» динейця трубок находится лупа, а в нижней части—узкая щель,\ затененная пластинкой. В агглютиноскопе имеется зеркало, которое направляет луч света в щель. Мельчайшие хлопья, освещенные сильным пучком света и увеличенные лупой, хорошо различимы.

А гглютинацию живых лептоспир изучают в препарате раздавленной капли при боковом освещении. На темном фоне видны склеившиеся лептоспиры в виде светя­щихся «паучков» (рис. 73).

Реакцию агглютинации применяют для диагно- стики многих инфекцион- ных болезней. Она ис- пользуется в двух целях: 1) обнаружение антител в сыворотке крови больно- го и 2) определение вида или типа микроба. Как и в других реакциях им- мунитета, неизвестный компонент выявляют по заведомо известному. Сле- довательно, МОЖНО уста- Рис. 73. Агглютинация лептоспир НОВИТЬ ВИД ИЛИ ТИП МИК- (образование «паучков»),

роба, применяя известную

агглютинирующую сыворотку, а также выявить антитела в сыворотке крови больного, вводя в реакцию известный антиген (микроб).

Агглютинирующие сыворотки и взвеси убитых микро­бов — диагностикумы изготовляют специальные производст­венные институты.

Реакцию агглютинации с целью определения вида микро­ба используют при брюшном тифе, пищевых токсикоинфек-циях, дизентерии, бруцеллезе, туляремии, чуме, холере и других заболеваниях.

Для приготовления агглютинирующих сывороток живот­ных (кролики и др.) подвергают гипериммунизации. Им вводят 5—7 раз подкожно, а затем внутривенно в возра­стающих количествах взвесь убитых, а последние 3 инъек­ции — живых микробов. Интервалы между инъекциями ко­леблются от 2 до 5—7 дней. Через неделю после окончания иммунизации делают пробное кровопускание и ставят ре-

149

акцию агглютинации для определения титра сыворотки,' Если титр сыворотки недостаточно велик, иммунизацию про­должают. При наличии высокого титра производят массив­ное кровопускание или тотальное обескровливание живот­ного.

Титром агглютинирующей сыворотки называется ее мак­симальное разведение, которое агглютинирует гомологич­ный микроб. Титр сыворотки указывается на этикетке ам­пулы.

Полученные таким путем агглютинирующие сыворотки называются видовыми, хотя они не лишены групповых аг­глютининов и могут в небольших разведениях склеивать родственные в антигенном отношении микробы. Поэтому для определения вида микроба надо ставить развернутую реакцию с сывороткой, разведенной от 1 : 100 до ее титра. Агглютинация микроба сыворотками в малых разведениях не имеет диагностического значения и расценивается как неспецифическая.

Более достоверные результаты при определении вида или типа микробов дают монорецепторные или типоспецифиче-ские сыворотки, которые не имеют групповых агглютининов. Для получения их извлекают групповые антитела, насыщая иммунные сыворотки неспецифическими микробами, имею­щими родственные со специфическим микробом антигены. После выдерживания в термостате отделяют агглютинат и получают монорецепторные сыворотки, которые имеют толь­ко специфические агглютинины. Они не вызывают групповой агглютинации.

При работе с этими сыворотками нет необходимости ста­вить развернутую реакцию и обычно ограничиваются агглю­тинацией бактерий на стекле.

Взвесь микробов (антиген) готовят из суточной или 20-часовой изучаемой культуры на скошенном агаре. Ее смывают 5 мл 0,85% раствора хлористого натрия и перено­сят в чистую пробирку. В каждую пробирку с разведенной сывороткой, за исключением контрольной, вносят по 1—2 капли взвеси микробов.

Реакцию агглютинации ставят по схеме (табл. 9). Все ингредиенты разливают по пробиркам в определенной по­следовательности.

Сыворотку, разведенную 1 : 100, наливают только в 1-ю, 2-ю и 9-ю пробирки, после чего 1 мл из 2-й пробирки пере­ливают в 3-ю пробирку ит. д., а из 8-й пробирки удаляют 1 мл.

Таблица У Схема постановки развернутой реакции агглютинации с целью определения вида микроба (титр агглютинирующей сыворотки 1 : 12 800)	Контроль	культуры	10-я	1 - 1
		сыворотки J	w	о о 1 - 1 2
	к СО			о о 00
	«			о о а ^ - t — со
	« со			о о — f *- со
	w LO			о о а ю
	к			о ( и 00
	3-я			8
	«			О о - - - ^
	w			о о
	rt / ft / Я / XO / О /-^ ft / 4 / -3 / 2 / ^ / я / я / fcf / <L> / °" / я / S			0,85% раствор NaCl Агглютинирующая сы­воротка, разведенная 1 : 100 Взвесь исследуемых микробов в каплях Конечное разведение сы­воротки Учет результатов

150

плюсом. По реакции агглютинации можно судить о при­надлежности микроба к тому или иному виду, если он агглютинируется специфической сывороткой, разведенной до титра или до половины титра.

Ориентировочная реакция агглютинации. В некоторых случаях, когда болезнь может быть вызвана различными видами микробов, для облегчения работы (ис­ключение постановки развернутой реакции агглютинации с несколькими сыворотками) ставят предварительно ориен­тировочную реакцию агглютинации. Так поступают при диагностике брюшного тифа и паратифов. Возбудителями брюшного тифа являются брюшнотифозная, а парати­фов — паратифозные А и В салмонеллы. Микроб, выде­ленный от больного брюшным тифом, агглютинируют на стекле тремя сыворотками. На два предметных стекла нано­сят брюшнотифозную, паратифозные А и В сыворотки, раз­веденные 1:10 или 1 : 25, и для контроля — изотонический раствор хлористого натрия. Во все 4 капли вводят взвесь исследуемого микроба, и покачивают стекла в течение 2—3 минут до появления агглютинации в какой-либо капле сыворотки. Развернутую реакцию агглютинации ставят с одной сывороткой, реагировавшей положительно в ориенти­ровочном опыте. Иногда микроб агглютинируется двумя сыворотками. В таком случае развернутую реакцию ставят с каждой из этих сывороток.

Ориентировочную реакцию агглютинации используют также для постановки предварительного диагноза, напри­мер при подозрении на заболевание холерой.

Реакция микроагглютинации на стекле при­меняется в том случае, если микробов очень мало. При вы­явлении холерного вибриона уже через 5—6 часов после по­сева материала исследуют пленку в жидкой среде в началь­ной стадии ее образования и ставят реакцию агглютинации на стекле. В пленке еще мало вибрионов и невооруженным глазом даже при положительном результате реакция не может быть учтена. Поэтому каплю сыворотки с вибриона­ми высушивают, фиксируют, окрашивают фуксином Пфейффера и микроскопируют. При положительной реак­ции все поле зрения свободно от микробов, только в от­дельных участках наблюдается скопление вибрионов. При отрицательной реакции вибрионы распределены равномер­но по всему полю зрения.

Реакция агглютинации для определения агглютининов в сыворотке больных использует-

152

В данной схеме 9-я пробирка является контролем сыворотки, 10-я пробирка — конт­ролем взвеси микроба. Пробирки энергично встряхивают и поме­щают на 2 часа в тер­мостат, затем произво­дят предварительный учет, начиная с контро-лей. В 10-й и 9-й про­бирках не должно быть агглютинации, наличие взвешенных хлопьев в опытных пробирках свидетель­ствует о положитель­ной реакции. Для оценки интенсивности реакции пробирки ос­тавляют при комнат­ной температуре на 18—20 часов, после че­го окончательно учиты­вают результат. Интен­сивность реакции вы­ражается плюсами. Полная агглютинация обозначается 4 плюса­ми (+ + + +)— жид­кость совершенно про­зрачна, а на дне осадок из хлопьев склеивших­ся микробов. Чем меньше микробов аг­глютинировалось, тем мутнее жидкость и тем меньше хлопьевидный осадок на дне. В зави­симости от этого ре­зультаты реакции от­мечают 3 (+ + +), 2 (+. + ) или одним ( + )■■

­ся с целью Подтверждения инфекционной болезНй, вызМН-ной тем или иным возбудителем; для диагностики брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), сыпного тифа (реак­ция с риккетсиями Провачека), бруцеллеза (реакция Рай­та и Хеддльсона), туляремии и других заболеваний.

Кровь у больного берут шприцем из локтевой вены в объеме 3—5 мл или стерильной иглой из пальца, мочки уха, а у маленьких детей из пятки в объеме 1 мл и помещают в термостат для свертывания. Сыворотку крови отделяют и разводят 0,85% раствором хлористого натрия от 1 : 50 или 1 : 100 до 1 : 800 или 1 : 1600. Более низкие концентрации антител обычно не используют лишь потому, что в крови могут находиться нормальные антитела, способные в не­больших разведениях вызывать реакцию агглютинации.

В качестве антигена в этой реакции используют диагно-стикумы — взвеси заведомо известных убитых и в отдельных случаях живых микробов. Диагностикумы из убитых микро­бов— весьма устойчивые препараты, они не теряют своих свойств в течение 2 лет и, кроме того, не представляют опасности заражения.

Техника постановки и учета реакции агглютинации с сывороткой больного не отличается от постановки развер­нутой реакции агглютинации для определения вида мик­робов.

Пробирки помещают на 2 часа в термостат, после чего извлекают и оставляют на 18—20 часов при комнатной тем­пературе. Исключением является реакция агглютинации с бруцеллами и риккетсиями, в этих случаях пробирки вы­держивают в термостате 20 часов. Диагностическое значе­ние имеет положительная реакция агглютинации в опреде­ленных разведениях. Так, например, диагноз бруцеллеза подтверждает положительная реакция в разведении сыво­ротки 1 :200, при туляремии такое же значение имеет по­ложительная реакция в разведении 1 : 100. Изучение этих реакций в динамике дает более достоверные результаты. Кровь у больного берут повторно и вновь ставят реакцию агглютинации с соответствующим диагностикумом. В про­цессе болезни, как правило, увеличивается количество анти­тел, следовательно, повышается титр агглютининов. Если положительные результаты агглютинации были обусловле­ны присутствием специфических антител в результате пере­несенного заболевания или вакцинации (анамнестическая или поствакцинальная реакция), титр антител не нарастает, а порой даже уменьшается.

153

В реакций агглютинации с сыворотками больных имеет значение выявление О-, Н- и Vi-антител. Обнаружение О-ан-тител подтверждает заболевание брюшным тифом, тогда как Н-антитела выявляются у перенесших заболевание или вакцинированных, Vi-антитела — у брюшнотифозных носи­телей.

Для обнаружения О-, Н- и Vi-антител используют О-, Н-, Vi-диагностикумы. О-диагностикумы готовят из густой взвеси бактерий, прогретых в водяной бане при 100° в тече­ние Р/г—2 часов или обработанных спиртом, в результате чего происходит разрушение жгутикового антигена. Для получения Н-диагностикума взвесь микробов обрабатывают формалином, который понижает активность О-антигена, сохраняя неизмененным Н-антиген. Vi-диагностикум полу­чают из определенных штаммов, обработанных спиртом брюшнотифозных салмонелл, содержащих Vi-антиген.

Реакция гемагглютинации не относится к реак­ции иммунитета, она является результатом действия фермен­та (гемагглютинина) вируса на эритроциты. Некоторые ви­русы вызывают агглютинацию эритроцитов определенных видов животных. Установлено, что вирусы гриппа и эпидеми­ческого паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, вирус клещевого энцефалита — эритроциты овец, вирус полиомиелита — эритроциты барана.

Реакцию гемагглютинации ставят в пробирках, на спе­циальных досках из плексигласа и на предметных стеклах. Материал, содержащий вирус, разводят изотоническим рас­твором от 1 : 10 до 1 : 1280. К 0,5 мл каждого разведения добавляют равный объем 1—2% взвеси эритроцитов. Про­бирки помещают в термостат на 30 минут, а стекла или доски оставляют при комнатной температуре на 45 минут. Учет реакции производят по характеру осадка.

Положительная реакция, обозначаемая 4 плюсами (+ + + +), характеризуется интенсивной и быстрой агглю­тинацией эритроцитов, которые осаждаются на дне и стен­ках пробирки или в углублениях доски из плексигласа, оса­док имеет звездчатую форму с фестончатыми краями. Тремя плюсами ( + + +) отмечается несколько менее интенсивная реакция с меньшим количеством агглютинированных эрит­роцитов на стенках, 2 плюсами (++) —с менее выражен­ным осадком и одним плюсом ( + ) —с незначительным аг-глютинатом только на дне пробирки. При отрицательном ре­зультате осевшие эритроциты образуют диск с равными краями.

154

­

молекулами неполных антител, обусловливают агглютина­цию эритроцитов (рис. 75), клеток бактерий или риккетсий.

Различают прямую и непрямую реакцию Кумбса. В прямой реакции устанавливают наличие антител в крови больного, связанных с эритроцитами, а в непрямой — не­связанных антител в сыворотке больного.

Во втором случае исследуемой сывороткой обрабатывают нормальные эритроциты, бактерии или риккетсий, а затем ставят реакцию так же, как и прямую реакцию Кумбса.

2

Рис. 75. Реакция Кумбса. / — прямая; 2 — непрямая.

Техника постановки прямой реакции Кумбса заключает­ся в том, что берут три различные взвеси эритроцитов: ис­следуемые эритроциты, нормальные (контроль) и сенсиби­лизированные известными глютининами. Предварительно их отмывают большими объемами изотонического раствора и готовят 1 % взвесь. Антиглобулиновую сыворотку титруют с применением эритроцитов, сенсибилизированных извест­ной дозой неполных антител. На белую поверхность фарфо­ровой пластинки наносят по 0,1 мл каждого разведения ан-тиглобулиновой сыворотки (не менее двух), к каждой капле добавляют по 0,05 мл взвеси эритроцитов.

Неполные антитела появляются при риккетсиозах по от­ношению к риккетсиям, при бактериальных инфекционных болезнях — к бактериям. Для выявления их ставят непря-

158

Титром вируса называют его наибольшее разведение, при котором еще наблюдается агглютинация эритроцитов.

Реакция торможения гемагглютинации. Если на вирус воздействуют специфической сывороткой, то агглютинация эритроцитов не наступает. Это явление назы­вается реакцией торможения гемагглютинации, протекаю­щей в результате взаимодействия антигена и антител.

Техника постановки реакции заключается в следующем. Сыворотку разводят от 1 : 10 до 1 : 2560. К каждому раз­ведению сыворотки в объеме 0,25 мл добавляют равное количество жидкости, содержащей вирус в 4-кратном титре (если вирус, разведенный 1 : 640, агглютинирует эритроци­ты, делают разведение 1 : 160) и выдерживают в термостате 30 минут. После извлечения из термостата добавляют по 0,5 мл 1—2% взвеси эритроцитов. Контролем является про­бирка, где сыворотка заменена изотоническим раствором NaCl.

Реакция читается после выдерживания в течение 30 ми­нут в термостате или 45 минут при комнатной температуре. Титром сыворотки называют ее максимальное разведение, которое вызвало задержку агглютинации эритроцитов.

Реакции гемагглютинации и торможения гемагглютина­ции широко применяются для диагностики вирусных бо­лезней.

Способность вируса агглютинировать эритроциты исполь­зуется для выявления его в зараженных культурах тканей в виде реакции гемадсорбции.

Реакция гемадсорбции. Во флаконы с тканью, где выращивались вирусы, вводят 0,2 мл 0,4% взвеси сте­рильных эритроцитов морской свинки или курицы. Пробирки оставляют при комнатной температуре в наклонном поло­жении на 3—5 минут, а затем помещают на несколько ми­нут во вращающийся барабан для удаления не адсорбиро­ванных эритроцитов. Реакцию учитывают, используя малое увеличение микроскопа. Ее считают положительной, если эритроциты адсорбируются на ткани беспорядочно или свое­образно группируются в виде гроздей, розеток и других скоплений. При отрицательном результате адсорбируются единичные эритроциты, а остальные остаются свободными. Добавление специфической сыворотки задерживает ре­акцию.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглю-т и н а ц и и основана на .способности эритроцитов, обрабо­танных антигеном,*склеиваться при воздействии сыворот-

155

мую реакцию. Риккетсий или бактерии обрабатывают иссле­дуемой сывороткой, а затем добавляют антиглобулиновую сыворотку, вызывающую агглютинацию.

Задания

1. Постановка ориентировочной реакции агглютинации культуры, выделенной от больного с подозрением на брюш­ной тиф, агглютинирующими сыворотками брюшного тифа, паратифов А и В.

2. Постановка и предварительный учет развернутой ре­акции агглютинации с целью определения вида микроба.

3. Изучение различных агглютинирующих сывороток и диагностикумов.

4. Демонстрация препарата Вас. anthracis, обработанно­го флюоресцирующими антителами (люминесцентная мик­роскопия).