Реакция преципитации

Реакцией преципитации называется осаждение из раство­ра антигена (преципитиногена) при воздействии на него им­мунной сыворотки (преципитина) и электролита. В этой ре­акции осаждаются частицы ультрамикроскопической вели­чины коллоидного раствора белка, полисахаридов. Она является весьма специфической и чувствительной. Посредст­вом реакции преципитации можно выявить антиген — белок в разведении 1 : 100 000 и даже 1 : 300 000, т. е. в столь ма­лых количествах, в которых он не обнаруживается химиче­ским путем.

Реакция преципитации применяется в микробиологиче­ской практике для диагностики ряда инфекционных заболе­ваний бактериальной и вирусной природы (эпидемический цереброспинальный менингит, сибирская язва, туляремия, чума, натуральная оспа, полиомиелит, аденовирусные забо­левания и др.)-

В судебной медицине реакция преципитации использует­ся с целью определения видовой принадлежности белка кро­ви. Из кровяных пятен делают вытяжку в 0,85% растворе поваренной соли, фильтруют, затем наслаивают на преци-питирующие сыворотки, содержащие антитела к белкам кро­ви разных видов животных и человека. Преципитация воз­никает в той пробирке, где антиген соответствует антителу.

С помощью реакции преципитации в санитарной практи­ке выявляют фальсификацию мясных, рыбных, мучных из-

143

делий, т. е. устанавливают, из какого мяса, рыбы или муки изготовлены те или иные продукты. /

Преципитирующие сыворотки изготавливают производст- венные институты путем гипериммунизации животных/В ка- честве антигенов для иммунизации применяют микробные взвеси, фильтраты старых бульонных культур, аутолизаты и солевые экстракты микробов, а также полные антигены бактерий. /

Иммунизация животных проводится циклами в течение не­скольких месяцев. В первые 2 недели антиген вводят еже­дневно малыми (0,5 мл), затем более массивными дозами 8—16 раз с интервалами 4—6 дней. Через 8—12 дней после последней инъекции антигена производят пробное кровопу­скание для определения титра сыворотки; если титр доста­точно высок, делают массивное кровопускание.

Титр преципитирующей сыворотки в отли­чие от титра других диагностических сывороток определяет­ся максимальным разведением антигена, который преципи-тируется данной сывороткой. Это объясняется тем, что антиген, участвующий в реакции преципитации, имеет ульт­рамикроскопическую величину и в единице объема его со* держится гораздо больше, чем антител в таком же объеме сыворотки. Сыворотки выпускают с титром не ниже 1 : 100 ООО.

Техника постановки реакции преципита­ции. В узкую пробирку (диаметр 0,5 см) наливают не-разведенную преципитирующую сыворотку в количестве 0,3—0,5 мл. Пастеровской пипеткой с тонко оттянутым ка­пилляром медленно по стенке (пробирку держат в наклон­ном положении) наливают по каплям антиген в таком же количестве. Пробирку осторожно, чтобы не смешать жид­кости, ставят вертикально. При правильном наслоении анти­гена на сыворотку четко видна граница между двумя жид­костями (рис. 69).

Постановка реакции обязательно сопровождается конт-ролями сыворотки (пробирки 2-я, 3-я, 4-я) и антигена (про­бирки 5-я, 6-я). Для контроля сыворотки в 3 пробирки (2-я, 3-я, 4-я) наливают преципитирующую сыворотку, в одну из них наслаивают известный специфический антиген, в дру­гую — экстракт, не содержащий антигена, и в третью — изо­тонический раствор. В одной пробирке реакция должна быть положительной, в двух других — отрицательной. Контроль антигена производят наслаиванием исследуемого антигена на нормальную сыворотку того же рида животного, от кото-

144

рого получена иммунная сыворотка. Контролю подлежит также! экстракт, не содержащий антигена. Его наслаивают на нормальную сыворотку. В этих двух пробирках (5-я и 6-я) преципитация не наступает. Реакцию учитывают в за­висимости от вида антигена и антител через 5—10 минут, 1—2 часа или через 20—24 часа. В случае положительной реакции\в первой пробирке на границе между сывороткой и

Рис. 69. Реакция преципитации (объяснение в тексте).

исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде бе­лого кольца. Ниже приводится схема постановки реакции преципитации (табл. 8).

В связи с тем что в реакции преципитации вообще и кольцепреципитации в частности нельзя установить количе­ства разных антигенов, участвующих в формировании пре­ципитата, разработаны и нашли практическое применение различные модификации реакции преципитации в геле, которые позволяют изучать антигенную структуру исследуемых микроорганизмов.

Сущность реакции заключается в том, что одноименные антиген и антитело, помещенные на определенном расстоя­нии в агаровом геле, диффундируют и при встрече обра­зуют преципитат в виде белых полос. Эта реакция широко используется в диагностике заболеваний, вызываемых ви­русами, риккетсиями и бактериями, продуцирующими ток­сины. Посредством реакции преципитации в геле можно оп­ределить неизвестный антиген по известной специфической сыворотке, а также неизвестные антитела по известному антигену. Для постановки реакции необходимо подготовить три ингредиента: антиген, сыворотку и гель.

145

Схема по Ингредиенты (в мл)	Таблица 8 становки реакции преципитации / Пробирка /
	1-я	2-я	3-я		4-я	5-я /	6-я
Преципитирующая сыво-
ротка (кролика)	0,5	0,5	0,5		0,5	0,5/
Испытуемый экстракт	0,5	—	—		—		—
Нормальная сыворотка						[ 0,5	0,5
кролика	—	—	—		—
Контрольный экстракт,
содержащий антиген,
соответствующий сы-		0,5					0,5
воротке	—		—		—
Контрольный экстракт,
не содержащий анти-
гена, соответствую-			0,5
щего сыворотке	—	—			—	—
+ 1 1 результатов или + — — 0,85% раствор NaCl Учет результатов	+ или		—		0,5	1

\

Вирусные антигены готовят из вируссодержащей жидко­сти тканевых культур, которую подвергают очистке и кон­центрации из аллантоисной жидкости и суспензии хорионал-лантоисной оболочки. Бактериальные антигены приготов­ляют так же, как для обычной реакции преципитации. Специфические сыворотки получают путем иммунизации кроликов. С целью выявления преципитирующих антител при вирусных инфекциях кровь больных людей берут на 1-й неделе болезни.

Гель изготовляют из агара лучших сортов, отмывают его в бидистиллированной воде и освобождают от осадка, гото­вят 0,8—1% раствор и стерилизуют. Реакцию преципитации в геле ставят в чашках Петри и на предметных стеклах. В обоих случаях в пластинке застывшего агара вырезают лунки, лучше специальным штампом, диаметром 3—4 мм на расстоянии 4—5 см. Центральную лунку заполняют антиге­ном, а периферические несколькими иммунными сыворотка­ми или различными разведениями одной сыворотки. Опыт сопровождается контролями и использованием ингредиен­тов, дающих заведомо положительные и отрицательные ре­зультаты. Предметные стекла, помещенные во влажные ка­меры (в чашки Петри с фильтровальной бумагой, смочен­-

146

клеток, последние склеиваются и выпадают § виде х/тоНьей на дно пробирки. 7

Р еакция агглютинации внешне проявляется различно в зависимости от вида антигена и величины клеток. У бак­терий взаимодействие сома­тических антигенов (О-анти-гены) со специфическими антителами происходит мед­ленно. Через 18—20 часов образуется мелкозернистый осадок. При встряхивании мелкие зерна агглютината не разбиваются. Подобная аг­глютинация наблюдается у туляремийных бактерий, бруцелл. Наличие жгутико­вого Н-антигена (сальмонел­лы брюшного тифа, парати-фов, токсикоинфекций) обус­ловливает быстрое появление агглютинации. Через 2—4 ча­са образуются легко разбивающиеся крупные рыхлые хлопья (рис. 71).

Рис. 72. Агглютиноскоп.

Риккетсии агглютинируются очень медленно, образуя тон­козернистый осадок. Учет реакции производят в агглютино-скопе (рис. 72), который состоит из двух металлических тру-

148

ной изотоническим раствором), чашки оставляют при комнатной температуре или при 37° и наблюдают за появ-лениеод полос преципитации. В опытах с вирусом полиомие­лита оки возникают через 18—20 часов, вирусом оспы — 4—5 часов, аденовирусами — через 20 часов. Слияние кон­цов преципитационных полос свиде­тельствует о тождестве сравнимых систем.

Одна из модификаций этой реак- ции сводится к тому, что лунки в агаре делаются по углам квадрата. Гомологические системы — антиген и соответствующую сыворотку — на- ливают в лунки, противоположные по диагонали (рис. 70). Специфиче- ские системы дают полосы, пересе- кающиеся под прямым углом и упи- рающиеся концами В лунки гетеро- _{Рис ж} Реакция преци- ЛОГИЧескоЙ системы. питации в геле.