Принципы устройства микроскопов и правила микроскопии

В настоящее время микробиологические лаборатории ис­пользуют не только обычные методы оптической микроско­пии в проходящем свете, но и специальные: в темном поле зрения, фазовоконтрастный, люминесцентный и электрон­ный.

Световой микроскоп *. Наиболее важной оптической частью микроскопа являются объективы, которые по степени увеличения и способу использования делят на сухие и им­мерсионные.

Сухие объективы с относительно большим фокусным рас­стоянием и слабым увеличением обычно применяют для изу­чения крупных биологических и гистологических объектов. Иммерсионные, или погружные, объективы имеют неболь-

¹ Более подробно устройство микроскопа изучается на кафедре физики.

8

под контролем глаза в масло, смотрят в окуляр и устанавли­вают вначале макровинтом, а потом микровинтом четкое изображение объекта. Левая рука должна находиться на микрометрическом винте в течение всего наблюдения. Ле­вым глазом, не закрывая правого, изучают препарат (рис. 3). С помощью бинокуляра (насадка с двумя тубуса-

шое фокусное расстояние, их используют главным образом при изучении микроорганизмов.

Мри микроскопии иммерсионным объективом обязатель­ным условием является погружение объектива в масло, по-казатель преломления которого близок показателю прелом-ления стекла (1,52). Для этих целей применяют: кедровое,

J

Рис. 2. Ход лучей при прохождении их через иммерсионное масло и воздух (бук­вы обозначают ход лучей).

персиковое масло, «иммерсиол», состоящий из персикового масла, канифоли, нафталинами салола. В этом случае пучок света, вышедший за пределы предметного стекла, не рас­сеивается, и лучи, не меняя своего направления, попадают в объектив (рис. 2).

Разрешающая способность иммерсионного объектива на­ходится в пределах 0,2 \х. Максимальное увеличение совре­менных микроскопов достигает 2000—3000.

При использовании иммерсионного объектива вначале центрируют оптическую часть микроскопа. Если тубус мик-роскопа раздвижной, то его устанавливают на длину 160 мм, -..нем поднимают конденсор до уровня предметного столика, Полностью открывают диафрагму, устанавливают объек-ТИВ 8 и при помощи плоского зеркала освещают поле зре­ния. Работая с конденсором Аббе, независимо от источника гнета, необходимо применять только плоское зеркало. На предметное стекло с окрашенным препаратом наносят кап­лю масла, иммерсионный объектив погружают осторожно

9

сор заменяют специальным параболлойд-конденсорбМ (рис. 4), в котором центральная часть нижней линзы затем­нена, а боковая поверхность зеркальная. Этот конденсор задерживает центральную часть параллельного пучка лучей, образуя темное поле зрения. Краевые лучи проходят через кольцевую щель, падают на боковую зеркальную поверх­ность конденсора, отражаются от нее и концентрируются в

ми и окулярами) микроскопирование производят одновре­менно обоими глазами. По окончании работы поднимают ту­бус, снимают препарат, затем салфеткой, прикрепленной к колонке микроскопа, удаляют масло с объектива и отводят его в сторону. Салфетку укладывают на предметный столик, опускают конденсор и тубус.

Для фотографирования микропрепаратов имеются микро­скопы (МБИ-6), снабженные постоянной фотокамерой.

Микроскопию в темном поле зрения в отличие от обыч­ной производят при боковом освещении; она относится к ультрамикроскопическим методам. В темном поле зрения наблюдают живые объекты величиной 0,06—0,04 — 0,02 jli. Чтобы получить яркое боковое освещение, обычный конден

10

его фокусе. Если же на пути луча нет каких-либо частиц, то он преломляется, падает на боковую зеркальную поверхность, отражается от нее и выходит из конденсора. Когда луч встречает на своем пути микробные клетки и другие опти­чески не гомогенные вещества, то свет в препарате отража­ется от них и попадает в объектив. Микробные клетки и дру­гие объекты в этом случае ярко светятся.

Источником искусственного света служит осветитель ОИ-7 или лампа 100—150 W в металлическом футляре. Для бокового освещения необходим параллельный пучок света, поэтому применяется только плоское зеркало микроскопа.

Правила микроскопии в темном поле зре­ния. Обычно исследуют материал сухой системой (объек­тив 40). Небольшую каплю изучаемого материала поме­щают на предметное стекло (толщина не более 1,1 мм) и накрывают покровным стеклом (толщина 0,17 мм), не допу­ская образования пузырьков воздуха. На верхнюю линзу

11

конденсора наносят кайлю иммерсионного масла, которое должно заполнить пространство между конденсором и пред­метным стеклом.

При микроскопии иммерсионной системой используют специальный объектив с диафрагмой и этим задержи­вают лучи, беспрепятственно проходящие через гомогенную среду.

Микроскопия в темном поле зрения применяется для об­наружения возбудителей сифилиса, возвратного тифа, леп-тоспирозов и других болезней, а также для изучения под­вижности микробов. Однако в темном поле зрения нельзя хорошо изучить форму и тем более внутреннее строение микроорганизмов. Для этой цели предложены видоизменен­ные методы оптической микроскопии.

Фазовоконтрастная микроскопия основана на том, что оп­тическая длина пути света в любом веществе зависит от по­казателя преломления. Это свойство используют с целью увеличения контрастности изображения прозрачных объектов.

Световые волны, проходя через оптически более плотные участки объекта, отстают по фазе световых волн, не прохо­дящих через эти участки. При этом интенсивность света не меняется, а только изменяется фаза колебания, не улавли­ваемая глазом и фотопластинкой. Препараты, не изменяю­щие амплитуду светового луча, а только фазу его колеба­ния, называют «фазовыми». Для повышения контрастности изображения фазовые колебания при помощи специальной оптической системы превращаются в амплитудные, хорошо улавливаемые глазом. Препараты в светлом поле зрения становятся резко контрастными — положительный конт­раст (рис. 5), при отрицательном фазовом контрасте на тем­ном фоне виден светлый объект.

Фазовоконтрастная микроскопия не увеличивает разре­шающей способности оптической системы, но помогает выя­вить новые детали структуры живых микробов, изучить раз­личные стадии их развития, влияние химических агентов, антибиотиков и других факторов.

Для фазовоконтрастной микроскопии используют следую­щие приспособления: 1) специальные объективы ахроматы (Ф10, Ф20, Ф40 и масляная иммерсия ФОИ90); 2) фазовый конденсор с револьвером и специальными диафрагмами для каждого объектива; 3) вспомогательный микроскоп малого увеличения; 4) осветитель ОИ-7; 5) светофильтры (лучше пропускающие зеленые лучи).

12

А ноптральный микроскоп. Устройство этого микроскопа основано на принципе использования фазовоконтрастной микроскопии. Одной из важнейших деталей прибора явля­ется линза объектива, расположенная вблизи его «выходного» зрачка, на кото­рую нанесен слой копоти или меди, по­глощающий не менее 10% света. Благо­даря этому фон поля зрения приобрета­ет коричневый цвет, микроскопируемые объекты имеют различные оттенки — от белого до золотисто-коричневого. Ход лу­чей света изображен на рис. 6. Аноп­тральный микроскоп применяют для ис­следования живых малоконтрастных объ­ектов: простейших, трепонем и некоторых вирусов.

Аноптральный метод микроскопии, по сравнению с фазовоконтрастным, дает большую разрешающую способность, глу­бину резкости и стереоскопичность изо­бражения объекта. Кроме того, значи­тельно устраняется ореол вокруг иссле­дуемого объекта.

Люминесцентная микроскопия. Явле­ние люминесценции (лат. — lumen свет) — холодное свечение вещества за­ключается в превращении энергии, погло­щаемой веществом, в видимое излучение. Свечение вещества происходит под влия­нием различных факторов и в зависимо­сти от них различают несколько видов люминесценции. Люминесцентная микро­скопия отличается от обычной тем, что объект рассматривается в излучаемом им свете во время облучения его ультрафио­летовыми лучами — первичная флюо­ресценция. Можно вызвать искусст­венно вторичную флюоресценцию путем специальной обра­ботки препаратов флюорохромами (акридин, аурамин, ней­тральный красный, трипафлавин, корифосфин НК и др.). Флюорохромы способны светиться под влиянием ультра­фиолетового, невидимого для глаза, излучения или под влиянием коротковолновых синих лучей видимой части спектра.

Объективы для наблюдения Методом фазовых койтрастой имеют фазовое темное кольцо. Оно нанесено на внутрен­нюю поверхность одной из склеенных линз, расположенной вблизи выходного зрачка объектива. Фазовое кольцо, слег­ка поглощая свет, вызывает смещение фазы, соответствую­щее четверти длины волны.

Фазовоконтрастный конденсор отличается от обычного тем, что в его фокальной плоскости помещены кольцевые

Рис. 5. Изображение в фазовоконтрастном микроскопе живой культуры сенной бациллы на мясо-пептонном агаре.

диафрагмы. Кроме того, имеется револьвер для смены диа­фрагмы (при смене объектива соответственно меняется и диафрагма). Под револьверным диском находится ирисовая диафрагма и два винта. Конденсор вставляют в конденсо-держатель микроскопа М-9 или МБИ-1.

Вспомогательный микроскоп вставляют в тубус микро­скопа вместо окуляра, с помощью которого наблюдают за центрированием кольцевой диафрагмы конденсора по отно­шению к фазовому кольцу объектива. По окончании цент­рировки вспомогательный микроскоп заменяют окуляром.

Существенным недостатком фазовоконтрастной микроско­пии является слабая контрастность получаемых изображе­ний, наличие ореолов вокруг объектов. В этом отношении аноптральный микроскоп (см. ниже) по сравнению с фазо-воконтрастным устройством обладает значительным преиму­ществом.

13

Техника флюорохромирования препаратов и

и к р о с к о п и и. Разные виды микроорганизмов обрабатывают раз-ичными флюорохромами: туберкулезные микобактерии — аурамином, ^нококки — акридином желт*ым, дифтерийные коринебактерии — кори-осфином НК и т. д. Для флюорохромирования, например, дифтерийных аринебактерий мазок фиксируют в течение 20 секунд в метиловом спир-3} промывают водой, обрабатывают в течение 10 минут в специальной смеси, состоящей из 5 мл водного раствора корифосфина I : 1000, 10 мл укс!усной киглоты, 85 мл дистиллированной воды, промывают водой, вы­сушивают. Дифтерийные коринебактерии в таком мазке флюоресцируют темно-зеленым цветом, зерна волютина — кирпично-красным, ложнодиф-терийные коринебактерии — бледно-желтым.

Для микроскопии флюорохромированных препаратов в ультрафиоле­товом свете необходимы: микроскоп, система фильтров, задерживаю­щих лучи с длиной волны больше ультрафиолетовых, и осветитель ОИ с ртутно-кварцевой лампой СВД-120А. Микроскопия производится в за­темненной комнате.

Микроскопия в видимом свете основана на флюоресцен­ции некоторых веществ под влиянием коротковолновых ви­димых синих лучей. Этот метод более прост и доступен. Недостатком этого метода по сравнению с микроскопией в ультрафиолетовом свете является отсутствие синих и фио­летовых цветов флюоресценции.

Микроскопию производят обычным микроскопом, в каче­стве источника света используют осветители ОИ-7 или ОИ-9.

Для получения сине-фиолетовой части спектра с опреде­ленной длиной волн применяют стеклянные или жидкие светофильтры в комбинации с фильтром, поглощающим крас­ную часть спектра. Излишние синие лучи устраняют свето­фильтром, находящимся на окуляре.

Преимущества метода флюоресцентной микроскопии по сравнению с обычными методами следующие: цветное изо­бражение, значительная контрастность, возможность иссле­дования морфологии убитых и живых микробов во взвесях из питательных сред, в клетках и тканях инфицированного животного в иммунологических реакциях, а также с целью обнаружения бактерий в небольших концентрациях.

Электронная микроскопия. В электронном микроскопе (рис. 7) вместо света используется поток электронов в без­воздушной среде, на пути которых находится анод. Источ­ником электронов является вольфрамовая проволока, на­греваемая электрическим током (электронная пушка). Оп­тические линзы заменены электромагнитами. Между вольфрамовой нитью и анодом возникает электрическое по­ле в 30 000—50 000 W, что сообщает электронам большую скорость и они, проходя через отверстие анода, попадают в первую электромагнитную линзу (конденсор). Электрон-

14

ные лучи по выходе из конденсора собираются в плоскости исследуемого объекта. Они отклоняются под разными угла­ми за счет различной толщины и плотности препарата м попадают в объективную электромагнитную линзу, снаб­женную диафрагмой. Электроны, мало отклонившиеся при встрече с объектом, проходят через диафрагму, электроны,

2. Освоение методики микроскопии иммерсионным объек­том окрашенных препаратов.

~. Демонстрация методов фазовоконтрастной и люминес' тной микроскопии.

отклонившиеся под большим углом, задерживаются, благо­даря чему обеспечивается контрастность изображения. Объективная линза дает промежуточное увеличенное изо­бражение, которое наблюдают через смотровое окно. Но­вейшие электронные микроскопы дают увеличение в 5 млн. раз.

Электронную микроскопию используют в микробиологии для изучения деталей строения микробной клетки и вирусов.