Задания

1. Учет результатов действия на микробы дезинфицирую­щих веществ (см. задание, стр. 105).

2. Изучение характера колоний протея OXi₉, образовав­шихся на обычном мясо-пептонном агаре и агаре, содер­жащем фенол. Приготовление мазков и окраска по Граму.

3. Учет результатов испытания чувствительности стафи­лококков к антибиотикам методом серийных разведений и бумажных дисков.

4. Учет результатов опыта трансформации резистентно­сти к антибиотикам определенных штаммов бактерий и по­лучения ауксотрофных мутантов.

самок делают кесарево сечение. Извлеченных животных^ вы­ращивают в специальных условиях. Кормление молоком, питательными смесями, содержащими витамины и микро­элементы, уход за животными проводятся с соблюдением асептики. Получены безмикробные цыплята, крысы, мор­ские свинки, поросята и другие животные и птицы. Безмик­робных животных подразделяют на монобиоты (полностью безмикробные животные), дибиоты (животные, зараженные одним видом микробов), полиобиоты (животные, заражен­ные несколькими видами микробов).

При экспериментальном заражении животных изучаемый материал вводят различными путями: накожно, подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутривенно, в центральную нервную систему, на слизистые оболочки, через рот, в дыха­тельные пути и др.

Животных заражают для выделения чистой культуры воз­будителя в тех случаях, когда нельзя получить ее другими способами. Например, при загрязнении исследуемых объек­тов посторонней микрофлорой, подавляющей рост возбуди­теля, при незначительном содержании микробов или пере­ходе их в фильтрующиеся формы. Так, при исследовании разложившихся трупов грызунов на присутствие пастерелл чумы заражают морских свинок. Они погибают через 3—7 дней при явлениях септицемии (размножение микробов в крови). Из крови сердца и внутренних органов легко вы­деляют чистую культуру возбудителя.

При отрицательном микроскопическом исследовании для выявления микобактерий туберкулеза морской свинке вво­дят мокроту или осадок мочи больного. У зараженного жи­вотного через 4—6 недель развивается генерализованный инфекционный процесс. На вскрытии во всех внутренних органах обнаруживают туберкулы (бугорки), в кото­рых содержится большое количество микобактерий ту­беркулеза.

Заражение восприимчивых животных для воспроизведе­ния инфекционного процесса применяется при болезнях, вызванных риккетсиями и вирусами. Инъекции мышам ма­териала от больного клещевым энцефалитом обусловливает возникновение параличей и летальный исход.

Микробы, выделенные от больного, для определения па­тогенности вводят животным при сапе, сибирской язве и других заболеваниях.

Для проведения подкожных и внутрикожных инъекций кроликов и морских свинок кладут на бок, одной рукой дер-

126

127

жат задние конечности, а другой обхватывают грудную клет­ку, вводя пальцы в подмышечные впадины.

При взятии крови из сердца животных кладут, на спину, растягивая в стороны немного вверх передние конечности (рис. 62).

Д ля внутривенных инъекций кролика заворачивают в по­лотенце и тесно прижимают конечности к туловищу.

особую осторожность, над кюветой с дезинфицирующим ра­створом. При удалении пузырьков воздуха, для предупреж­дения разбрызгивания, иглу вводят в стерильную вату, пе­ремещают шприц иглой вверх и выталкивают воздух вместе с небольшим количеством материала. Загрязненную вату снимают пинцетом и погружают в дезинфицирующий раст-

Мышей берут левой рукой за хвост, опускают на стол, туловище быстро прижимают к столу двумя пальцами пра­вой руки и, передвигая их по спине, захватывают кожу над головой. Животное слегка растягивают. Можно держать мышь одной рукой, в этом случае кожу головы фиксируют пальцами левой руки, а хвост — между мизинцем и ладонью той же руки (рис. 63), таким образом экспериментатор об­ходится без помощника.

Инструменты, необходимые для заражения животных (шприцы в разобранном виде, иглы, пинцеты), кипятят в во­допроводной воде в течение 10—20 минут. Патологический материал, взвеси микробов набирают в шприц, соблюдая

128

вор. После заражения шприцы и инструменты вновь кипя­тят 30 минут и более в зависимости от устойчивости микро­бов.

Техника заражения животных. Для подкожного вве­дения двумя пальцами левой руки захватывают кожу и в образовавшуюся складку вводят иглу (рис. 64). Проколов кожу, слегка меняют направление иглы, чтобы материал не выливался после извлечения ее, затем впрыскивают со­держимое шприца, надавливая поршень левой рукой, после чего быстро извлекают иглу, предварительно положив на нее вату, смоченную спиртом. У кроликов и морских свинок подкожные инъекции удобно делать на спине и животе, у крыс и мышей на спине, у корня хвоста.

129

Рис. 64. Техника подкожного заражения.

Внутрикожное введение требует более тщатель­ного ^удаления шерсти. Кожу растягивают двумя пальцами левой руки. Иглу вводят под острым углом отверстием кверху в поверхностный слой эпидермиса так, чтобы конец ее просвечивал (рис. 65). При инъекции жидкости появля­ется четко отграниченное возвышение, которое не исчезает

прокалывают брюшную стенку и вводят содержимое шприца.

Методика внутривенного заражения определяет­ся в зависимости от вида животного. У кроликов исполь­зуют краевую ушную вену. После удаления шерсти вдоль наружного края уха для лучшего кровенаполнения зажи­мают основание его и растирают, поколачивают щелчками

в течение 3—5 минут. Кожа над ним приобретает вид ли­монной корки. Внутрикожно вводят не более 0,1—0,2 мл жидкости.

При накожном способе заражения исследуе­мый материал втирают стеклянной палочкой в неповреж­денную или скарифицированную кожу. Скарификацию (на­сечки) делают скальпелем или пером для оспопрививания. Материал втирают в местах, недоступных для слизывания (на спине, ближе к голове).

Внутрибрюшинное заражение производят в ле­вую нижнюю треть живота. Животное держат головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. Кожу прока­лывают иглой под острым углом, затем устанавливают шприц под прямым углом. Толчкообразным движением

Рис. 65. Внутрикожное заражение морской свинки.

или смазывают ксилолом край уха. Иглу вводят в вену под острым углом (рис. 66) по направлению тока крови, перед инъекцией сдавливание прекращают. Жидкость свободно поступает в кровь при легком надавливании на поршень шприца. Если игла не в вене, жидкость поступает с трудом, образуя в месте введения вздутие. В этом случае следует сделать второй укол ближе к основанию уха. Перед извле­чением иглы вену сдавливают стерильной ватой и не сни­мают ее до прекращения кровотечения.

Мышам и крысам инъекции делают в хвостовые вены. По­мощник держит мышь и сдавливает корень хвоста. Для более полного кровенаполнения сосудов хвост погружают на 1—2 минуты в воду, нагретую до 50°. Прокол лучше про-

72

9*

130

изводить у основания хвоста, где сосуды расположены по­верхностнее или в нижней его трети, где вены шире. Во время инъекции сдавливание у корня хвоста прекращают.

Морским свинкам материал вводят в вену на внутренней поверхности бедра, предварительно разрезают и отсепаро-вывают кожу. После инъекции на рану накладывают швы.

Рис. 66. Внутривенное заражение кролика.

Для введения материала в сердце или взя-*я крови из сердца кролика или морскую свинку фиксируют, как описано выше, голова животного должна находиться слева от экспериментатора. Шерсть с левой сто­роны груди выстригают, кожу дезинфицируют спиртом и йодной настойкой. Большим пальцем левой руки экспери­ментатор слегка надавливает на правую сторону грудной стенки животного, а указательным пальцем нащупывает толчок сердца и одновременно определяет положение ребер. Иглу вводят в месте толчка в межреберный промежуток перпендикулярно грудной клетке. Если игла находится в полости сердца, в шприц толчками поступает кровь, после чего вводят материал или набирают кровь. В случае неуда­чи иглу извлекают и делают прокол вновь, тщательно про­-

верив место толчка (нельзя изменять направление иглы, не извлекая ее, так как можно повредить мышцы сердца). Затем место прокола дезинфицируют йодной настойкой. Обычно после взятия большого количества крови животно­му вводят под кожу стерильный изотонический раствор хло­ристого натрия в объеме, равном взятой крови.

Заражение субдуральное (под твердую мозговую оболоч­ку), интрацеребральное (внутрь мозга), интраокулярное (в переднюю камеру глаза), через пищеварительный тракт, в дыхательные пути производят в тех случаях, когда иной путь введения не вызывает у экспериментального животно­го типичного инфекционного процесса.

Зараженных животных содержат в лаборатории или в спе­циальном помещении, расположенном в отдалении от пи­томника. После заражения их помещают в клетки или высо­кие стеклянные банки, закрывающиеся сверху металличе­ской сеткой. Помещение должно быть теплым и сухим. Особенно чувствительны к холоду мыши, а морские свинки чувствительны не только к холоду, но и к повышенной влаж­ности воздуха. Животные должны регулярно получать пи­щу с достаточным количеством витаминов, воду и система­тически подвергаться наблюдению в определенное время.

Определение вирулентности микробов. При изучении свойств патогенных микробов в ряде случаев определяют их вирулентность (степень патогенности). Это необходимо для характеристики микробов, выделенных от больных, но­сителей и из внешней среды, установления остаточной виру­лентности живых вакцин (оспенная, сибиреязвенная), вы­явления напряженности иммунитета у животных и т. д.

Вирулентность микробов выражается Dim (Dosis letalis minima), т. е. минимальным количеством микробов, вызы­вающих гибель животного определенного вида и Dl₅₀ (или LD₅₀) —минимальной дозой, вызывающей гибель 50% за­раженных животных.

Для определения Dim используют микробы, выращенные на плотных или жидких питательных средах. Культуры на плотных питательных средах смывают 0,85% раствором NaCl и устанавливают определенное количество микробных тел в 1 мл (методика изложена на стр. 171). Куль­туры, выращенные в жидких питательных средах, разводят в несколько раз. Минимальная смертельная доза может рез­ко варьировать в зависимости от вида и типа микроба, а также от вида животного, места введения и других факто­ров.

132

133

Определение Dlm пневмококка производят на мышах. Предварительно культуру в сывороточном бульоне разводят от Ю-¹ до Ю-¹⁰ (т. е. от 1 : 10 до 1 :10 000 000 000). В ряд пробирок наливают пипеткой по 1,8 мл пептонной воды, затем в первую пробирку вносят 0,2 мл культуры пневмо­кокка (таким образом разводят ее 1:10). Из первой про­бирки после тщательного перемешивания переносят 0,2 мл во вторую (получают разведение 1 : 100) и т. д. Каждое разведение готовят отдельной пипеткой и вводят внутрибрю-шинно по 0,5 мл 2—3 белым мышам весом 18—20 г. Пнев­мококк относят к вирулентным, если мыши гибнут через 36—48 часов после введения культуры, разведенной 10^-8.

Dl₅₀ является более достоверным показателем при опре­делении вирулентности микробов, так как в меньшей сте­пени зависит от индивидуальной чувствительности живот­ных.

Из культуры бактерий или вирусов делают серийные 10-кратные разведения. Каждое разведение вводят не менее 4—6 животным. В связи с тем что трудно подобрать такое разведение культуры, которое вызывало бы гибель 50% жи­вотных, применяют метод статистического учета и исчисле­ния Dl₅₀, предложенный Ридом и Менчем. При исследова­нии материала, разведенного от Ю^-1 до Ю^-8, требуется 8 групп животных. После прекращения наблюдения отме­чают количество погибших животных в каждой группе и оп­ределяют Dl₅₀ при помощи специальных таблиц.

Вирулентность микробов зависит в большой мере от вы­работки ими экзо- и эндотоксинов. Сила токсина опреде­ляется Dim, DI50 и другими единицами.

Определение Dim токсина. 1 Dim экзотоксина (столбнячный, дифтерийный, ботулинический, возбуди­телей газовой анаэробной инфекции) равна наимень­шему количеству токсина, которое вызывает гибель жи­вотного определенного вида и веса через определенное вре­мя. 1 Dim дифтерийного токсина представляет собой то наименьшее количество его, которое вызывает гибель мор­ской свинки весом в 250 г через 96 часов; 1 Dim столбняч­ного токсина — минимальное количество его, вызывающее гибель морской свинки весом 350 г через 96 часов. Кроме морских свинок, для определения Dim других токсинов ис­пользуют белых мышей. В производственных лабораториях устанавливают силу токсина другими единицами, которые в меньшей мере зависят от индивидуальной чувствительно­сти животных: Lt (Limes Tod), Lo (Limes Null), Lf (Limes

134

Все данные йскрытий протоколируют. Записи должны быть подробными и четкими. В протоколе отмечают дату заражения и характер введенного материала.

Порядок исследования трупа. Труп животного кладут на спину, растягивают в стороны лапы и фиксируют препаро­вальными иглами или острыми гвоздями на доске (рис. 67).

Рис. 67. Фиксация белой мыши для вскрытия.

До фиксирования труп осматривают, отмечают изменения наружных покровов, наличие язв (при туберкулезе), выпа­дение шерсти и изменение цвета кожи (при анаэробной газовой инфекции) и т. п.

До вскрытия инструменты переносят из стерилизатора в банку со спиртом, а перед употреблением их обжигают на пламени.

Вскрытие наружных покровов начинают с про­дольного разреза кожи от нижней челюсти до лобка. Кожу отсепаровывают, по сторонам делают надрезы по направ­лению к конечностям и откидывают в стороны лоскуты ко­жи, обнажая всю переднюю поверхность. Отмечают сос­тояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов. Если последние изменены, делают посевы в питательные среды

136

floculationis). Характеристика этих единиц изложена в спе-иальных руководствах.

Определение Dim и Dl₅₀ эндотоксина используют при изу­чении тифозных и паратифозных салмонелл, патогенных штаммов Е. coli и некоторых других бактерий. Из микроб­ных клеток извлекают эндотоксин, например из брюшноти­фозных салмонелл — глюцидо-липиднопротеидный комп­лекс, который затем вводят в различных разведениях чувст­вительным животным.