Действие биологических факторов на микроорганизмы

В естественных условиях микробы находятся в самых раз­нообразных ассоциациях (фаги, бактерии, водоросли, акти­номицеты, грибы, простейшие и др.) - При совместном суще­ствовании микроорганизмов между ними возникают различ­ные взаимоотношения. Наибольшее практическое значение имеет явление антагонизма. Микробы-антагонисты дейст­вуют на другие виды своими продуктами метаболизма. В противоположность микробам-антагонистам имеются мик-робы-синергисты, выделяющие продукты, стимулирующие рост других видов.

Выделение микробов-антагонистов и микробов-синерги-стов из почвы производят методом «скученных пластинок>. С этой целью густую взвесь почвы сеют на поверхность мя­со-пептонного агара в чашки Петри. На фоне скученного роста более отчетливо проявляется действие микробов-анта­гонистов и микробов-синергистов. Вокруг первых колоний наблюдаются зоны задержки роста, вокруг вторых — более пышный рост бактерий. Микробы-антагонисты и продукты их жизнедеятельности практически используют для угнете­ния или задержки роста гнилостных и патогенных бактерий (молочнокислые бактерии, фаги, антибиотики).

Испытание активности выделенного микроба-антагониста производится следующим образом. Посередине чашки с мя­со-пептонным агаром засевают петлей в виде полосы су­точную бульонную культуру микроба-антагониста, чашку помещают в термостат. Через сутки перпендикулярно росту микроба-антагониста подсевают суточные бульонные куль­туры тест-микробов (золотистый стафилококк, Е. coli) и

110

чашки снова помещают в термостат. Иногда посев антаго­ниста и тест-культур производят одновременно. Учет результатов регистрируется через сутки. Бактерии, подавляе­мые микробом-антагонистом, растут на некотором расстоя­нии от него, зоны задержки роста измеряются в сантимет-рах. Контролем служат заведомо чувствительные и устойчи­вые штаммы одноименных бактерий.

Продукты жизнедеятельности некоторых микробов приме­няют в лабораторной практике для стимуляции роста бак­терий. Так, из культуры Вас. mesentericus fuscus получен активный препарат — манифестатор, который стимулирует рост чумных пастерелл, возбудителя ложного туберкулеза грызунов, дифтерийных коринебактерий. Из сарцин получен белок типа альбумина, в высушенном виде в разведении I : 1 ООО ООО он стимулирует рост чумных пастерелл. Сарци-пы, стафилококки и дрожжи применяют живыми в виде кормилок» для регенерации фильтрующихся форм различ­ных бактерий.

Задания

1. Продолжение санитарно-бактериологического исследо­вания воды: а) подсчет колоний, выросших в чашке с мясо-иептонным агаром и определение микробного числа воды; б) пересев в розоловую среду из пробирок со средой Эйк-мана.

2. Определение количественного загрязнения воздуха ми­кробами: а) подсчет колоний бактерий, выросших в чашке с мясо-пептонным агаром; б) определение числа микробов в 1 м³ воздуха по формуле Омелянского.

3. Посевы отделяемого слизистой оболочки зева на кро­вяной агар.

4. Посевы смывов с рук у работников столовой в глюкозо-псптонную среду.

5. Посевы испражнений на среду Эндо и мясо-пептонный <-irap.

6. Определение активности фага: а) по методу агаровых слоев Грациа; б) по методу Аппельмана (демонстрация).

7. Определение фагочувствительности стафилококков, вы­деленных от носителей.

8. Демонстрация лизогенных бактерий до и после облуче­ния ультрафиолетовыми лучами.

9. Изучение явлений антагонизма и синергизма у микро- бов (демонстрация).

111

ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Успех лабораторной диагностики инфекционных болез­ней, выявление носителей и установление инфицирования внешней среды в значительной степени зависит от учета из­менчивости микроорганизмов. Как известно, под влиянием различных воздействий микроорганизмы претерпевают са­мые разнообразные изменения: 1) модификации, при кото­рых приспособительные изменения не затрагивают наслед­ственного аппарата бактерий и, следовательно, не передают­ся по наследству; 2) рекомбинации (трансформация, трансдукция, конъюгация), характеризующиеся внутривидо­выми наследственными изменениями некоторых свойств мик­робов; 3) мутации, сопровождающиеся изменением состава или порядка расположения азотистых оснований и опреде­ленных участков нуклеиновых кислот: приобретенные но­вые свойства в результате изменения генетической структу­ры передаются по наследству в неограниченном числе по­пуляций.

Модификационные (ненаследственные) изменения могут быть легко устранимы общепринятыми лабораторными прие­мами; изменения же, возникшие вследствие рекомбинаций и мутаций, как правило, не поддаются реверсии, так как они связаны с изменением наследственного аппарата бактерий.

С изменчивостью морфологических, культуральных, фер­ментативных и других свойств микроорганизмов в практиче­ской работе микробиологи встречаются довольно часто. Так, иногда при посеве патологического материала в первых ге­нерациях Е. coli, дизентерийные, дифтерийные и другие бак­терии образуют нитевидные, шаровидные и колбовидные формы. Микроорганизмы с измененной морфологией выде­ляют из почвы, воды и других объектов внешней среды. Эти проявления полиморфизма можно воспроизвести в опытах воздействием на бактерии различными физическими, хими­ческими или биологическими факторами.

Влияние физических факторов на изменчивость бактерий может быть самым разнообразным (лучи-рентгеновы, радия, ультрафиолетовые, ультразвук, повышенная температура и ряд других факторов). Культивирование сибиреязвенных бацилл и антракоидов при температуре 42° вместо опти­мальной 37° способствует утрате спорообразования. У си­биреязвенных бацилл значительно ослабевают вирулентные свойства. Такого рода изменения, полученные Луи Пасте-ром и Л. С. Ценковским, были закреплены длительным

112

культивированием бацилл (12—24 дня) при температуре 42 . Так, были получены живые вакцины против сибирской язвы.

Д ействие химических веществ на морфологию и другие свойства бактерий можно изучить в опытах с сублетальны­ми дозами фенола, хлорной извести, солей лития, сульфа-

нпламидных препаратов и других химических аген­тов.

К мясо-пептонному рас­плавленному агару при­бавляют 0,1% 'фенола, смешивают и разливают в чашки Петри. На под­сушенный феноловый и обычный мясо-пептонный агар (контроль) сеют штрихами односуточную бульонную культуру про­тея ОХ19. Посевы поме-мещают в термостат при температуре 37°. Через сутки из колоний приго­товляют мазки и окраши­вают их по Граму. В маз­ках из колоний на фено-

ловом агаре наблюдают нитевидные формы, нередко с кол-бовидными утолщениями на концах, в контролях — типич­ные палочковидные формы протея.

113

Изменчивость бактерий под влиянием биологических фак­торов учитывается в лабораторной диагностике различных заболеваний, в том числе и дифтерии. При подкожном вве­дении морской свинке типичных дифтерийных коринебакте-рий уже в первые часы после заражения животного можно выделить измененные формы. В крови и во внутренних орга­нах обнаруживаются коккоподобные (рис. 58, У), сдвоенные бобовидные, дрожжеподобные (рис. 58, 2), нитевидные (рис. 58, <?), колбовидные (рис. 58, 4) и другие формы. У некоторых морфологически измененных возбудителей на-олюдается образование пигмента, нарушение ферментатив­ных и токсигенных свойств. Эти приобретенные свойства в одних случаях могут быть временными, в других — они за­крепляются и передаются по наследству. Наиболее глубокие изменения у бактерий возникают под влиянием фага (лизо-геиная или фаговая конверсия) и антибиотиков. Для возвра-

N Заказ № 7

щсния в исходную форму модифицированных возбудителей | шнечных заболеваний их многократно пересевают в бульон I I % глюкозы или 10% желчи, а также в среду с маннитом.

Некоторые формы наследственной изменчивости могут быть воспроизведены в лабораторных условиях. Наиболее и монстративной является трансформация, которая пред-< гавляет собой замену одного признака другим посредством введения генетического материала от бактерии-донора к бак-п-рии-реципиенту (рис. 59). В качестве трансформирующего агента служит ДНК бактерии-донора, которая получается С помощью определенного разработанного метода.

Опыт трансформации стрептомициноус-. I о й ч и в о с т и чувствительным клеткам реци­пиента. Культуру определенного штамма засевают в мясо-пептонный бульон. После 8—12 часов роста определяют кон­центрацию бактерий, разводят культуру до нескольких де-Сятков миллионов клеток в 1 мл; к 2 мл этой взвеси добав­ляют 15—20 у/мл ДНК стрептомициноустойчивого штамма донора. Через 30—60 минут пребывания в термостате про­изводят, посев в чашки с мясо-пептонным агаром, содержа­щим 150 у/мл стрептомицина. Через 24—48 часов учитывают наличие роста трансформантов и определяют степень их ус­тойчивости к стрептомицину методом серийных разведений.

Специальными методиками производят трансформацию фаголизабильных, ферментативных, антигенных и других свойств бактерий.

Мутанты обнаруживают специальными методами. Мутан­ты с измененными культуральными свойствами различают по характеру колоний (размер, структура, цвет и др.). Фер­ментативные прямые мутанты выявляют в минимальных пи­тательных средах, содержащих только соли и углеводы [глюкоза 1 г, К2НРО4 7 г, КН₂Р0₄ 2 г, натрий цитрат 5 Н₂0 0,5 г, MgS0₄ • 7Н₂0 0,1 г (NH₄)₂S0₄ 1 г, агар, про­мытый несколько раз, 15 г, вода дистиллированная 1000 мл] при отсутствии источников органического азота. Штаммы, утратившие способность синтезировать необходимые для них метаболиты, не растут на этих средах, для их культи­вирования вводят факторы роста. Биохимические мутанты могут терять свойство синтезировать один фактор роста (одинарный мутант), два фактора (двойной мутант) и т. д. Обратными мутантами называют штаммы бактерий, кото­рые вновь приобретают способность к синтезу того или ино­го метаболита. Для их выявления используют минимальные среды. Так, с целью обнаружения и количественного учета

115

т иминового мутанта Е. coli сеют на поверхность питательной среды в чашке Петри 1 млн. клеток этого мутанта, предва- рительно обработанного одним из мутагенов. Количество колоний подсчитывают и определяют частоту появления об- ратных мутаций. Мутантные клетки бактерий выявляют ме- тодом отпечатков (рис. 60) или реплик У^^Х (replica plating).

/у | Печатку вырезают по диаметру чашки Петри

jhrf в из текстолита или другого материала, не изме-

Ш J няющегося при стерилизации, и обтягивают

Ш ф бархатом. Печатку накладывают на" поверх-

ЩГ "'^ч^ ность агара с колониями, затем чашку перево-

рачивают вверх дном, под ее тяжестью на ворсинках бархата остаются клетки отдельных бактерий (имеются специальные автоматиче­ские аппараты для отпечатывания колоний). Печатку переносят в чашки с минимальной и полной средой. Отсутствие роста в минималь­ных средах и наличие его в присутствии того или иного метаболита позволяет установить потребность в нем.

Рис. 60. Дифферен­циация ауксотрофов и прототрофов мето­дом replica plating.

Постановка опыта получе­ния ауксотрофных мутантов* 5 мл 18-часовой бульонной культуры Е. coli центрифугируют, промывают 0,85% раствором NaCl, вновь центри­фугируют и ресуспендируют в 20 мл фосфатного буфера (1000 мл дистил­лированной воды, КН₂Р0₄ 3 г, NaHP0₄ 7 г, NaCl 4 г и MgS0₄ 0,2 г). Затем взвесь бактерий переносят в чашки Петри слоем в 1 мл и помещают под лампу БУВ на расстоянии 10 см, экс­позиция 10—15 минут. Взвесь облу­ченных бактерий в количестве 0,1 мл высевают в чашки с мясо-пептонным агаром. Через сутки учитывают негативные участки, со­ответствующие мутантным колониям на мясо-пептонном агаре. Эти колонии засевают в 6 чашек с минимальным агаром, содержащим различные группы аминокислот. При наличии роста в одной из чашек колонии рассевают на ми­нимальный агар, содержащий отдельные аминокислоты этой группы.

116

Фильтрующиеся формы бактерий получают из фильтратов культуры бактерий, выделений животных и человека, воды, почвы и других объектов- внешней среды.

Фильтраты засевают в жидкие, полужидкие и плотные сре­ды с подсевом кормилок (сарцины или стафилококки) или тбавлением дезоксирибонуклеиновой кислоты. Регенера­ция фильтрующихся форм происходит медленно, через не­сколько фаз, общих для большинства бактерий. Начальную фазу регенерации авизуальных форм на плотных питатель­ных средах можно наблюдать при помощи микроскопа в по­севах Е. coli, шигелл, сальмонелл и других бактерий. В этой фазе на агаре наблюдаются очень нежные, прозрачные, сте­кловидного характера образования. В мазках-отпечатках обнаруживаются грамотрицательный детрит, изредка—неж­ные палочки. При благоприятных условиях фильтрующиеся формы снова переходят в исходные, в других — они приоб­ретают новые свойства, передающиеся по наследству.

Под влиянием антибиотиков и других факторов клетки бактерий могут увеличиваться и принимать форму больших шаров с вакуолями, мелкими и крупными зернами, так на­зываемые L-формы. Они скудно растут в жидких питатель­ных средах; на плотных средах образуют пенистые, как бы врастающие в толщу агара колонии.

Диссоциация у бактерий наступает при старении культуры в условиях длительного хранения, в организме выздоравливающих человека и животных, под влиянием им­мунных сывороток, лекарственных препаратов и других не­благоприятных факторов. Микробы одного вида в процессе диссоциации образуют различные по культуральным свойст­вам колонии: S-формы (гладкие), R-формы (шероховатые), О-формы (переходные) и М-формы (слизистые). Большин­ство микробов патогенны в S-форме, у них с изменением формы колоний появляются новые свойства. Сальмонеллы брюшного тифа и паратифов А и В в R-форме могут ут­рачивать жгутики, ферментативную активность, вирулент­ность. Возбудители сибирской язвы, чумы, туберкулеза, ко­ринебактерии дифтерии типа гравис обладают патогенными свойствами в R-форме. Это качество является стойким и пе­редается по наследству.

При диагностике кишечных заболеваний следует учиты­вать форму колоний выделенных бактерий. Культуру в R-форме необходимо многократно пересевать из мясо-пеп­тонного бульона на мясо-пептонный агар (колонии в R-фор­ме с трудом переходят в S-форму) и отбирать гладкие ко­лонии. Колонии бактерий в S-форме обладают присущими для данного вида характерными свойствами, что облегчает их идентификацию.

65

Лекарственная устойчивость у микробов про-, является к химиопрепаратам и антибиотикам. Она возни­кает в результате селекции (отбора уже имеющихся в по­пуляции резистентных особей), мутаций и рекомбинаций.

Патогенные бактерии (стафилококки, возбудители дизен­терии, патогенные Е. coli и др.), выделенные от больных и носителей, испытывают на чувствительность к антибиотикам методом последовательных серийных разведений в бульоне и агаре или с помощью бумажных дисков, пропитанных ан­тибиотиками.

Метод последовательных разведений в бульоне считается наиболее точным при обеспечении стандартных условий и соответствующих контролей. В ряд пробирок, кроме 1-й, наливают по 0,5 мл бульона. В 1-ю и 2-ю пробирки вносят 0,5 мл раствора антибиотика, содержащего 100 ЕД в 1 мл. Содержимое 2-й пробирки перемешивают и переносят 0,5 мл бульона в 3-ю пробирку. И так до последней пробирки, из которой удаляют лишние 0,5 мл бульона. Контрольная про­бирка должна содержать 0,5 мл бульона без антибиотика. Бульонную культуру испытуемого микроба разводят тем же бульоном (чаще 1 : 1000) и в каждую пробирку с различ­ными разведениями антибиотика, а также в контрольную, добавляют 1,5 мл этой культуры. В 1-й пробирке будет со­держаться 25 ЕД, или 25 мг/мл, во 2-й — 12,5 ЕД, в 3-й — 6,25 ЕД и т. д. (табл. 6).

Посевы помещают в термостат при 37° и через 18—20 ча­сов отмечают задержку роста микробов. Количество анти­биотика, вызвавшее полную задержку роста, является наи­меньшей действующей концентрацией (НДК), которая из­меряется в единицах на миллилитр.

Определение чувствительности бактерий методом последовательных разведений в агаре. Агаровую среду расплавляют, охлаждают до 48° и оставляют при этой температуре в водяной бане. Антибио­тик разводят последовательно в стерильной воде. В ряд ча­шек добавляют по 1 мл каждого разведения антибиотика и

9 мл агаровой среды, содержимое смешивают. Используя 12 чашек, получают концентрацию антибиотика от 100 до 0,04 ЕД. После застывания агара дно чашки делят на

10 сегментов, 9 из них засевают испытуемыми культурами бактерий, 10-й— культурой с известной чувствительностью. Испытуемыми культурами засевают также контрольную чашку без антибиотика. Чашки помещают при 37° на 18— 24 часа и затем исследуют рост бактерий. Концентрацию

118

лица 6 $ мясо-	Контроль культуры	Ю I *0 | CD ^
Таб едений i	10-я	0,5 —> 1,5 0,048
Схема определения чувствительности микробов к антибиотикам методом последовательных разв пептонном бульоне	« СП	0,5 1,5 0,097
	« со	0,5 1,5 0,195
	к	8 LO | LO СО о *-« о~
	« <Г>	0,5 1,5 0,781
	« ю	0,5 1,5 1,562
	к	0,5 1,5 3,125
	3-я	0,5 1,5 6,25
	2-я	0,5 1,5 12,5
	1-я	| о - £
	я / * / CU / я / \о / о / Си / с / / s / W / 3 / t-1 / м / я / * / <и / а / ж / s	Мясо-пептонный бульон Раствор, содержащий 100 ЕД антибиотика Бульонная культура бактерий, разведенная 1 : 1000 Полученные разведения анти­биотика в единицах

антибиотика, которая вызвала полную задержку роста, обо­значают как наименьшую дей­ствующую концентрацию.

Диапазоны чувствительно-сти микробов к пенициллину по Уэлчу представлены п табл. 7.

Определение чувст­вительности микробов к антибиотикам мето­дом диффузии. Стандарт­ные диски из фильтровальной бумаги (диаметр 10 мм), про­питанные определенным коли­чеством соответствующего ан­тибиотика, изготовляются спе­циальными лабораториями.

Из исследуемой суточной культуры бактерий готовят 2 млрд. взвесь, 1 мл переносят в чашку с обычным мясо-пеп-тонным агаром (рН 7,1—7,3) и распределяют равномерным покачиванием чашки по всей поверхности среды. Избыток жидкости отсасывают пасте­ровской пипеткой и среду хо­рошо просушивают. Можно также засеять непосредствен­но исследуемый материал (гной, мокрота, раневое отде­ляемое и др.). На поверхность засеянной питательной среды (на равном расстоянии другог друга и на расстоянии 2 см от края) стерильным пинце­том накладывают бумажные диски, пропитанные пеницил­лином, стрептомицином, хлор-тетрациклином, левомицетином и др. Каждая чашка служит для испытания действия 4 ан­тибиотиков. Результаты учиты-

Рис. 61. Комбинированный диск, приме­няемый для определения чувствительно­сти бактерий к антибиотикам.

чивость испытуемого микроба к данному антибиотику. Ма­лочувствительные микроорганизмы дают зону задержки роста до 15 мм, чувствительные — от 15 до 20 мм, высокочув­ствительные— более 25 мм. Одним из вариантов обычных бумажных дисков является комбинированный диск (рис. 61).

Эти оценки не являются строго объективными, так как они зависят от степени диффузии антибиотика в питатель-

120

4.Изучение культуральных свойств S- и R-форм золоти­стого стафилококка на мясо-пептонном агаре и в бульоне.

5.Испытание чувствительности стафилококков, выделен­ных из отделяемого слизистой оболочки носа и зева, к ан­тибиотикам методом бумажных дисков.

6. Опыт получения ауксотрофных мутантов.

7. Определение чувствительности стафилококков к фагу и активности его по методу Грациа и Аппельмана.

8. Определение результатов посева отделяемого слизис­той оболочки зева, смывов с рук и испражнений.