3 Адания

1. Изучение ферментативных свойств и подвижности выделен­ных культур. Ознакомление с оп­ределителем микробов. Ориен­-

тировочное определение вида выделенных культур на осно-п.чшш полученных данных, внесенных в схему (табл. 4).

2. Обнаружение некоторых видов анаэробных клостридий -осевах, произведенных методом последовательного разве-

""ПИЯ.

3. Действие физических и химических факторов на бакте­рии: а) влияние ультрафиолетовых лучей на Е. coli и ста­филококки (демонстрация); б) действие химических веществ (10% раствор хлорной извести) в опытах дезинфекции за­раженного материала.

4. Проведение санитарно-бактериологического исследова­ния речной воды: а) посев воды для определения общего ко­личества микробов в 1 мл; б) посев воды в среду Эйкмана для определения коли-титра.

5. Посев седиментационным методом воздуха учебной комнаты.

МИКРОФЛОРА ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА. ФАГИ. ДЕЙСТВИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

Микрофлора тела человека

Микробы тела человека представлены самыми разнооб­разными видами, но наибольшее эпидемиологическое значе­ние имеют микробы кишечника, кожи, слизистой оболочки нна и носа.

Посев испражнений. Стерильной петлей берут не-шачительное количество испражнений (проба должна быть свежей), тщательно распределяют их на небольшом участке среды Эндо в чашке Петри и затем параллельными штриха­ми сеют на остальной поверхности среды. Этой же петлей производят посев в чашку с мясо-пептонным агаром. Изоли­рованные колонии можно также получить при последова­тельном посеве испражнений шпателем в 3 чашки с пита­тельной средой. После суточного пребывания посевов при 37° в среде Эндо преобладают красные колонии Е. coli; н мясо-пептонном агаре, кроме Е. coli, развиваются и другие .1 >робные представители микрофлоры кишечника.

Посев смыва с рук. Стерильным ватным тампоном, смоченным 0,85% раствором поваренной соли и взятым сте­рильным пинцетом, протирают кожу между пальцами рук, ногтевое ложе, кожу под ногтями. Для обнаружени

пробирку с глюкозо-пептонной средой (1% пептонную воду с 0,5% глюкозы наливают в пробирки с поплавками для улавливания газа и стерилизуют). Одну петлю среды из про­бирки с тампоном, после вращения ее между ладонями, за­севают параллельными штрихами в чашку с мясо-пептон­ным агаром для выращивания других микроорганизмов (кокки, грибы и др.). Пробирку с глюкозо-пептонным бульо­ном помещают в термостат при 43°. Через 7—12 часов производят пересев из глюкозо-пептонной среды в розоло-вый агар. Выявление кишечной палочки проводят по мето­ду, применяемому при исследовании воды. Чашку с посе­вами на мясо-пептонном агаре помещают на сутки в термо­стат с температурой 37°, затем на несколько дней оставляют при комнатной температуре, после чего учитывают резуль­таты.

Посев отделяемого слизистой оболочки зева. Слизь из зева, взятую стерильным ватным тампо­ном, засевают в чашку с кровяным или сахарным агаром. Первые штрихи посева проводят тампоном, затем для полу­чения изолированных колоний материал, нанесенный там­поном, рассевают на поверхности агара петлей. Посевы культивируют при 37°.

Фаги

Фаги обнаруживают в различных объектах, где находят­ся соответствующие виды бактерий, актиномицетов, сине-зеленых водорослей.

Фаги дизентерийных бактерий выявляют в испражнениях больных людей, фаги брюшнотифозных бактерий — в ис­пражнениях, моче и крови. Во внешней среде они длительно сохраняются в сточных водах, загрязненных водоемах, поч­ве, кишечнике мух, на овощах, фруктах и пр. Стафилокок­ковые фаги могут содержаться в отделяемом слизистой оболочки зева, носа, гнойном содержимом ран, фаги ана­эробных микробов — в раневом отделяемом, почве и дру­гих субстратах.

Различают фаги вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги, проникая.в клетку, формируют новые особи и разру­шают клетку, умеренные фаги инфицируют бактерии, но не лизируют их, бактерии-носители умеренных фагов назы­ваются лизогенными. Эту неинфекционную форму фага в ли-зогенных бактериях называют профагом.

Выделение вирулентного фага и опреде­ление его активности. Для выделения фага иссле­

106

д уемый материал центрифугируют, испражнения и другие объекты полужидкой и плотной консистенции предваритель­но разводят 0,85% раствором NaCl. Надосадочную жидкость В количестве 1 мл переносят в 30 мл мясо-пептонного бульо­на, засеянного 1 мл молодой (6—18-часовой) культурой со­ответствующего микроба. Посевы помещают в термостат при температуре 37° на сутки. Затем посев фильт­руют через фильтр Зейт-п а, фильтрат разводят 1 : 10, 1 :100 и 1 :1000, прибавляют по 0,05 мл культуры. Контролем слу­жит бульонная культура без фильтрата. Через 18— 20 часов пробирки извле­кают из термостата и учи­тывают результат. При наличии фага наступает просветление среды, в контрольном посеве отме­чается нормальный рост бактерий.

Наиболее эффективным методом выявления фага является метод агаровых слоев, предложенный

Грациа в 1936 г. Чашки с 25—30 мл 1,5% мясо-пептонного агара, покрытые стерильной бумагой, тщательно высушива­ют под бактерицидной лампой в течение нескольких часов, затем закрывают крышками и оставляют до следующего дня при комнатной температуре. Для выделения фага фильтрат разводят бульоном (1 : 10, 1 :100, 1 : 1000) и в пробирку, со­держащую 2,5 мл расплавленного 0,7% агара, вносят 1 мл фильтрата того или иного разведения и 0,1 мл известной чувствительной к фагу культуры бактерий. Содержимое про­парки быстро смешивают и выливают в чашки на подсушен­ную поверхность 1,5% агара. После равномерного распреде­ления смеси для ее уплотнения чашки оставляют на 30 ми-пут при комнатной температуре, а затем помещают в термо­стат при 37°. При наличии даже единичных корпускул фага ОН обнаруживается в виде отдельных негативных колоний, при большой концентрации — в виде сплошного лизиса бак-Iерпп. С целью ускоренной диагностики чумы, холеры учет

107

Таблица 5 Контроль	культуры	12-я	Ю | юр | V о'о
	фага	П-Я 1	ю.ч. 1 I 1 о
те о			4,5 0,05
те о>			4,5 0,05
те X			4,5 0,05
£ с			4,5 —> 0,05
оду Ai б-я			4,5 0,05
Г4 <и S те О ^ Б			4,5 0,05
в? —.			4,5 0,05
3-я			4,5 —> 0,05
ма тит] 2-я			4,5 0,05
Схе ^^-^^^ Пробирка Ингредиенты (в мл)^^""""^^^^			Мясо-пептонный бульон 4,5 Исследуемый фаг 05 0,85% раствор NaCl — Бульонная культура бактерий 0,05 Учет результатов

результатов проводится через 3—37г часа.

Активность (титр фага) вы­ражают максимальным разве­дением, в котором проявляет­ся литическое действие. Более точным м етодом определения активности фага является под­счет количества активных кор­пускул в единице объема. При использовании метода агаро­вых слоев это легко выполни­мо, так как формируются чет­кие отдельные негативные ко­лонии (рис. 57). Следует засе­вать несколько разведений фа­га, каждое в две параллельные чашки. После 18 часов пребы­вания в термостате подсчиты­вают количество негативных колоний и умножают на число разведений.

Например, при исследовании по методу агаровых слоев в 1 мл фага в разведении 10~⁷ на чашке было обнаружено 25 колоний, следовательно, титр фага (количество корпус­кул в I мл) равен 2,5- 10⁷ — 2,5 • 10⁸.

Определение актив­ности фага по методу Аппельмана (табл. 5) про­водят в мясо-пептонном бульо­не или бульоне Хоттингера. Для этого берут ряд пробирок, со­держащих по 4,5 мл бульона и нумеруют их. В первую про­бирку вносят 0,5 мл испытуе­мого фага, смешивают его со средой и другой пипеткой пере­носят 0,5 мл в следующую про­бирку и т. д., таким образом его разводят последовательно

от (Ю-¹) до 1:1000000000 (10~⁹) и выше. В каж-ю пробирку разведенного фага вносят по 0,05 мл 18-ча-вой бульонной культуры соответствующих бактерий. Две пробирки являются контрольными: одну пробирку засе­вают только культурой бактерий (контроль на наличие и культуре фага), во вторую пробирку наливают только фаг (контроль стерильности фага). Учет результатов производят после 18—24 часов пребывания пробирок в термостате. Титр фага отмечается наибольшим разведением, в котором на­блюдается полный лизис (прозрачная среда) и условно обозначается в виде отрицательной степени разведения. Для лечебного и профилактического применения титр

дизентерийного фага должен находиться в пределах Ю-8_₁₀ю

Определение фагочувствительности бак­терий, выделенных от больных, имеет диагностическое значение. Готовят 2-миллиардную взвесь из исследуемой и заведомо фагочувствительной культуры бактерий и нали­вают по 1 мл в чашки с хорошо подсушенным мясо-пептон­ным агаром. Осторожным покачиванием чашек взвесь рав­номерно распределяют по поверхности агара, избыток отса­сывают пастеровской пипеткой, посевы подсушивают в термостате и фаг наносят пастеровской пипеткой в виде сте­кающих капель, затем чашки со слегка приоткрытыми крыш­ками снова помещают в термостат для подсушивания, после чего поворачивают их вверх дном. Учет результатов по наличию «стерильных» зон производится через 18—20 часов.

Умеренные фаги способны долгое время существо­вать в неинфекционной фазе развития. При нарушении рав­новесия между профагом и лизогенной бактерией наблюда­ется формирование зрелой инфекционной формы фага и ли­зис клетки. Этот процесс иногда возникает в естественных условиях спонтанно или под влиянием индукции, т. е. воз­действия провоцирующего фактора, приводящего к превра­щению профага в фаг.

С целью получения индуцированных фагов на лизогенные бактерии действуют различными физическими, химическими и биологическими факторами. К физическим факторам отно­сят рентгеновы лучи и ультрафиолетовое облучение, к хи­мическим — яблочную кислоту, перекись водорода, сульфа-тиазол и др. Из веществ биологической природы известны антибиотики. Вирулентные мутанты умеренных фагов яв­ляются мощным биологическим фактором изменчивости.

Индукция лизогенных бактерий ультр афио летовыми лучами. Молодую (8-часовую) культуру бактерий

разводят 1 : 20—1 : 30 вероналовым буфером и по 5 мл разливают в чашки Петри, опытную культуру бактерий облучают в открытом виде, а контрольные выдерживают в зоне облучения закрытыми. Время облучения от 30 до 180 секунд. Источником ультрафиолетовых лучей служит бактерицидная лампа БУВ. Облученные и контрольные взвеси в количестве 3—3,5 мл засевают в пробирки с 5 мл соответствующей питательной среды. После нескольких ча­сов инкубации в термостате посевы испытывают на присут­ствие фага.