Методы культивирования и выделения риккетсии

Риккетсии являются внутриклеточными паразитами, они выращиваются в искусственных средах, содержащих пере­живающие ткани (метод Мейтлендов и Цинссера), или в пе-

84

В настоящее время широко применяют культуры переви­ваемых тканей различного происхождения (см. Культиви­рование вирусов).

Риккетсии выращивают при 35—36° в течение 8—14 дней, обильное размножение их наблюдается при пониженном ме­таболизме.

Риккетсии хорошо размножаются в курином эмбрионе при заражении в полость желточного мешка (метод Кокса). Эмбрионы помещают в термостат при температуре 35—36° па 6—8 дней.

Культивируют риккетсии также в кишечнике платяных вшей по методу Вейгля, им вводят взвесь риккетсии стек­лянным капилляром в кишку через анальное отверстие. По методу Пшеничнова и Райхера риккетсии выращивают на личинках вшей, которых кормят дефибринированной кровью через мембрану кожи трупа. В качестве эпидермомембраны используют кожу цыпленка.

Методы культивирования и выделения вирусов

Для культивирования и выделения вирусов служат кури­ные эмбрионы, культура ткани, чувствительная к данному вирусу.

Культивирование вирусов в развивающемся курином эм­брионе. Культивирование вирусов в курином эмбрионе ши­роко применяется вирусологами в различных направлениях: для диагностики заболеваний, изучения вирусов, приготовле­ния вакцин и др. Используют обычно 7—15-дневные заро­дыши белых кур.

Заражение производят на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную полость (рис. 53), желточный мешок (рис. 54), амниотическую полость, тело зародыша и т. д. в строго асептических условиях в боксах.

85

Яйцо помещают в овоскоп и отмечают границы воздуш­ного мешка, хорионаллантоисной оболочки и место положе­ния эмбриона.

Н аиболее распространен способ введения заразного мате­риала на хорионаллантоисную оболочку. Скорлупу над воз-

н™ ™' ^3аР^ажение в аллантоис-ную полость куриного эмбриона с™_Р^В°_п^ЗД^^{ШНОе п}Р^оетранство; 2-отвер-лочка T^P7_nⁿnJ ^г-^ск°Р--'Упная обо­лочка- ₅ „*°Р^ионал,лантоисная обо-жж 7 *-^желт<>чный мешок; 6-бе­лок, 7 _ амнион; 8- плод; S - аллан-тоисная полость.

душным пространством и сбоку над хорионаллантоисной оболочкой дезинфицируют спиртом и йодом, стерильной иг­лой прокалывают ее над воздушным пространством. Сбоку выпиливают пилкой отверстие в форме тре- или четырех­угольника (каждая сторона равна §—6 мм), снимают скор­лупу, слегка надрывают нижележащую оболочку, вследст­вие давления воздуха хорионаллантоисная оболочка запа-­

оболочку, вследст­вие давления воздуха хорионаллантоисная обдает, образуя воздушное пространство. На оболочку шприцем наносят 0,05—0,1 мл материала. При заражении В аллантоисную полость прокалывают хорионаллантоисную оболочку и погружают иглу на 1—2 мм. Отверстие закры­вают стерильным покровным стеклом, прикрепляя его полу­застывшим парафином.

Более простым способом является заражение в желточ­ный мешок. Яйцо помещают на подставку тупым конусом вправо. Иглой прокалывают скорлупу над воздушным про-етранством, углубляя ее на 3—4 см, попадают в желточный мешок, затем в него вводят инфицированный материал в количестве 0,2—1 мл.

Для введения материала в амниотическую полость скор­лупу над воздушным пространством срезают и снимают не­большой участок скорлупной оболочки. Сложенными бран-шами пинцета осуществляют прободение хорионаллантоис­ной оболочки над эмбрионом. Амниотическую оболочку захватывают пинцетом, выносят ее наружу, производят инъекцию материала и закрывают яйцо крышкой от бюкса.

Слепой способ заражения в амниотиче­скую полость. В овоскопе определяют местоположение эмбриона по его тени на скорлупе. В центре тупого конца яйца делают прокол, через который иглой шприца или пасте­ровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром вносят ма­териал, содержащий вирус. Пипетку вводят резким толчком в направлении тела зародыша. Зараженные эмбрионы вы­держивают в термостате при температуре, благоприятной для данного возбудителя.

Время вскрытия зараженных куриных эмбрионов зависит от вида исследуемого вируса.

Вскрытие эмбрионов производят в асептических условиях. Яйца помещают в штатив воздушным мешком кверху. Ме­сто вскрытия стерилизуют, так же как перед заражением. Скорлупу над воздушным мешком удаляют ножницами. При вскрытии яиц, зараженных на хорионаллантоисную оболочку, макроскопически изучают наступившие изменения в оболочке и в эмбрионе. Ножницами надрезают хорионал­лантоисную оболочку и содержимое яйца выливают в чаш­ку Петри. Оболочку, оставшуюся на внутренней поверхности скорлупы, осторожно отделяют пинцетом, промывают в 0,85% растворе поваренной соли, переносят в сухую чашку и тщательно расправляют.

Размножение вирусов осповакцины и герпеса на хорион­аллантоисной оболочке вызывает пролиферативно-некро-

87

86

тические поражения в виде беловатых бляшек. Величина и форма их специфичны для каждого вида вируса. Вирусы на­капливаются в большом количестве и образуют характерные оксифильные включения (цитоплазматические при осповак-цине и ядерные при герпесе).

Эмбрионы, зараженные в аллантоисную и амниотическую полости, вскрывают также после обработки скорлупы. Скор­лупу и подскорлупную оболочку, прилегающие к отверстию, удаляют, шприцем или пастеровской пипеткой отсасывают вначале аллантоисную, а затем амниотическую жидкость.

Некоторые вирусы вызывают гибель эмбрионов в опреде­ленные сроки после заражения.

Независимо от метода заражения для обнаружения виру­са применяют реакции гемагглютинации, связывания комп­лемента и ставят биологические пробы.

Культура тканей для выращивания вирусов. Методы культур тканей применяют в вирусологии более 40 лет (ме­тод Максимова, Карреля, переживающих тканей Мейтлен­дов и Цинссера и др.). За последние годы подобраны к определенным вирусам весьма чувствительные ткани и раз­работаны новые методы их культивирования (Эндерс и др.).

Источниками получения тканей являются эмбрионы и взрослые животные. Наиболее часто используют эмбрио­нальные ткани кур, мышей и человека, также успешно при­меняют эмбрионы свиней и коров.

Из зрелых тканей наибольшее распространение приоб­рели амнион человека и почки обезьян. Амниотические обо­лочки человека собирают в родильных домах, соблюдая сте­рильные условия. Из амниотической оболочки получен пе­ревиваемый штамм клеток FL (Фог, Лунд), он представляет собой быстро растущие эпителиоподобные клетки. Постоян­ный перевиваемый штамм СОЦ получен из сердечной тка­ни обезьян циномольгус. Для неперевиваемой культуры из зрелых тканей используют измельченные почки обезьян ма­каки резус, свободных от латентных вирусов, в частности SV₄₀.

Культура из измельченных зрелых тканей (метод Мейтлендов). Этот метод в современной мо­дификации применяли для выращивания вируса полиомие­лита с целью изготовления инактивированной вакцины Сол­ка. Свежие почки обезьян освобождают от капсулы, уда­ляют почечные лоханки и оставляют наружную часть почеч­ной паренхимы. Ткань измельчают ножницами в среде № 199 (см. ниже) и переносят в матрасы емкостью 1 л с не­-

88

большим количеством этой среды. Матрасы встряхивают в специальной качалке (20 покачиваний в минуту). Через сут­ки ткань заражают вирусом, после 4—7 дней материал об­рабатывают для производства вакцины.

Получение первично трипсинизированных однослойных культур. Для этой цели используют эмбрионы человека (10—12-недельный срок беременности), кур, почки обезьян, кроликов и др.

Наиболее широкое применение имеют почки обезьяны, их обрабатывают так же, как описано выше. Измельченную ткань многократно промывают раствором Хенкса и зали­вают 0,25% раствором трипсина. Во флаконы опускают маг­нит и размешивают ткань на электромагнитной мешалке при 32° 10 минут. Первую порцию трипсинизированных клеток удаляют, прибавляют раствор трипсина и размешивают 15—20 минут. Вторую и третью порции трипсинизированных клеток сливают и сохраняют при 4°. Последние две порции клеток центрифугируют при 2000 об/мин в течение 30 минут, после чего дважды отмывают раствором Хенкса, осадок раз­водят синтетической средой № 199, чтобы получить взвесь, содержащую 10 000—40 000 клеток в 1 мл. Подсчет их про­изводят в гемометрической камере Горяева. К взвеси клеток добавляют пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл, раз­ливают взвесь клеток по 1 мл в пенициллиновые флаконы или пробирки и помещают в термостат на 4—5 дней. Куль­туры трипсинизированных тканей сохраняют до 20 дней, при смене питательной среды каждые 4—5 дней, как правило, они не перевиваются.

Перевиваемые культуры опухолевых кле­ток широко используются во всех вирусологических лабо­раториях мира: HeLa (клетки фиброкарциномы шейки мат­ки умершей женщины по имени Helen L.), Нер-2 (выделены от больного раком гортани), KB (получены от больного ра­ком языка), Детройт 6 и др.

Растут эти клетки в виде однослойных культур, вирусоло­гические лаборатории получают их из Московского научно-исследовательского института вирусных препаратов. Ста­бильные штаммы клеток (HeLa, Нер-2, Детройт 6 и др.) пе­ревивают каждые 4—7 дней, для чего их необходимо суспендировать, отделяя от стенок флакона.

Применяют различные методы отделения слоя тканей от поверхности стекла: 1) встряхивание, соскабливание со стек­ла; 2) действие протеолитическими энзимами или поверхно­стно-активными веществами.

89

Штаммы клеток, Неплотно прикрепляющиеся к стенкам флаконов, переходят в суспензию при легком встряхивании питательной среды. При более плотном прикреплении клет­ки отделяют от стекла кусочком резины на стеклянной па­лочке. Снятые хлопья обычно суспендируют пипеткой.

Из химических веществ наиболее широкое применение приобрел трипсин. При трипсинизации однослойной ткани питательную среду удаляют из флакона и заменяют 0,25% раствором трипсина. Флакон в течение 10 минут несколько раз осторожно встряхивают, полученную суспензию цент­рифугируют при 1000 об/мин. Трипсин удаляют и заменяют питательной средой.

К числу поверхностно-активных веществ относится версен (диаминоэтантетрауксусная кислота), применяют его в ви­де растворимой двунатриевой соли в концентрации 1 : 5000 в буферном солевом растворе при рН 7,4. Ткань во флаконе после удаления питательной среды промывают солевым рас­твором и затем прибавляют подогретый до 37° версен. Фла­коны ставят в термостат на 10—15 минут и встряхивают содержимое, чтобы суспендировать клетки. Затем суспензию центрифугируют и надосадочную жидкость заменяют пита­тельной средой.

Решающее значение для успешного культивирования раз­личных тканей имеют питательные среды, которые делятся на естественные и синтетические.

В естественные питательные среды входят изотонические солевые растворы, сыворотки животных и эм­бриональные экстракты. Солевые растворы создают необхо­димую буферность и участвуют в обмене веществ ткани. Некоторые из них содержат индикатор феноловый красный, соду и углекислоту *.

Для приготовления широко применяемого солевого раствора Хепк-са основного берут: NaCl 80 г, KG 4 г, MgS0₄ • 7Н₂0 2 г, СаС1₂ 1,4 г, КН₂НР0₄ 0,6 г, Na₂HP0₄ • 2Н₂0 0,6 г, глюкозы 10 г, фенолового крас­ного 0,02 г, воды бидистиллированной до 1 л.

Основной раствор хранят в холодильнике и перед употреблением его разводят в 10 раз дистиллированной водой. Разведенный раствор разли­вают по 10 мл в пенициллинсзые флаконы, которые закрывают ватными пробками и стерилизуют текучим паром. Затем в каждый из них нали­вают по 0,25 мл 0,25% раствора ЫаНСОз, закрывают резиновыми проб­ками и помещают в холодильник на 2—3 дня для растворения углекис­лоты.

Сыворотки служат источником белкового питания. В зависимости от характера культивируемой ткани применяют сыворотки человека, лоша-

¹ Феноловый красный облегчает учет реакции среды. Сода и углекис­лота являются буферами.

90

материала, обработанного антибиотиками. После 20—30 ми­нут контакта с тканью материал отсасывают пипеткой, нали­вают питательную среду и флаконы помещают в термостат. Ткань просматривают, пользуясь малым увеличением мик­роскопа, каждые 3—5 дней для выявления цитопатического действия — изменений в ткани, вызванных вирусами. Не­которые из них (вирусы полиомиелита и Коксаки группы В) разрушают чувствительные штаммы эпителиальных клеток и типа фибробластов, другие вызывают гибель части клеток (вирусы энцефалита).

Ряд вирусов не вызывает изменений культуры ткани и оказывает очень слабое действие (возбудитель гриппа), в последнем случае применяют реакцию гемадсорбции и гем-агглютинации (см. стр. 154, 155).

Титрование вируса в культуре ткани производят методом подсчета бляшек. Последовательно разведенную суспензию вируса наносят на однослойную культуру ткани в 100-грам­мовых матрасах, трижды отмытую фосфатнобуферным со­левым раствором. Матрасы ставят в термостат на один час для адсорбции вируса. При постановке опыта в чашках Пет­ри их помещают в термостат с подачей С0₂. Затем одно­слойную культуру ткани быстро покрывают смесью, содер­жащей равные объемы 20% лошадиной сыворотки, разведенной солевым раствором с 0,04% индикатора ней­трального красного и 3% расплавленного агара, также при­готовленного на солевом растворе.

После застывания агара матрасы переворачивают и по­мещают в термостат при 37°. Результат учитывают еже­дневно при боковом освещении на белой или светло-зеленой поверхности. При изучении вируса полиомиелита уже через 48—96 часов инкубации в слое на розовом фоне наблюдают­ся неокрашенные бляшки диаметром 1—3 мм, образо­вавшиеся за счет цитопатического действия вируса. Счи­тают, что каждая особь вируса может образовать одну бляшку.