Выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий (продолжение). Изучение ферментативных свойств бактерий

Для идентификации выделенной чистой культуры микро­организмов необходимо, кроме изучения морфологических, тинкториальных и культуральных особенностей, определить их ферме нтативные свойства.

81

Выявление ферментов, расщепляющих уг­леводы, производят в средах Гисса. При ферментации бактериями углеводов с образованием кислоты среды ме­няют цвет, что создает впечатление пестроты — «пестрый» ряд. В зависимости от изучаемого рода и вида бактерий подбирают среды с соответствующими моно- и дисахарида-ми (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза и др.), полиса­харидами (крахмал, гликоген, инулин и др.), высшими спир-

Рис. 52. Последовательные фазы разжи­жения желатины холерны_М^Ф вибрионе.

тами (глицерин, маннит и др.), в процессе ферментации которых образуются альдегиды, кислоты и газообразные про­дукты (С0₂, Н₂, СН₄). Молоко при ферментации лактозы свертывается.

В полужидкие среды с индикатором BP (см. стр. 69) посев производят уколом, прокалывая среду петлей до дна пробирки. Сальмонеллы брюшного тифа не ферментируют лактозу, расщепляют глюкозу, маннит и мальтозу с образо­ванием кислоты без газа, сальмонеллы паратифа А и В также лактозоотрицательны, но перечисленные углеводы сбраживают с выделением кислоты и газа. Е. coli наиболее активна, она расщепляет с образованием кислоты и газа лактозу и многие другие углеводы.

Протеолитические ферменты у бактерий обна­руживают посевом в столбик желатины (рис. 52). Посевы выдерживают при комнатной температуре (20—22°) в те­чение нескольких дней, при этом регистрируют не только наличие разжижения, но и характер его. Разжижение мо­жет быть послойное, что характерно^для бактерий синезе-леного гноя; холерный вибрион разжижает желатину в виде гвоздя, стафилококки — в виде чулка. Рост сибиреязвенной

82

бациллы напоминает перевернутую вершиной вниз елочку, характер разжижения желатины послойный. Протеолитиче-ское действие микроорганизмов можно наблюдать при посевах на уплотненную сыворотку, вокруг колоний появля­ются углубления (разжижение). В молоке наступает про­светление — растворение свертка казеина с образованием пептона, что придает молоку желтоватый цвет (пептониза-ция молока).

Показателями более глубокого расщепления белка слу­жат индол, аммиак, сероводород и другие соединения. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы мик­роорганизмов в бульон или пептонную воду. Посевы выдер­живают в термостате в течение 1—3 дней.

Для выявления индола по способу Мореля узкие по­лоски фильтровальной бумаги смачивают горячим насыщен­ным раствором щавелевой кислоты (индикаторная бумага) и высушивают. Индикаторную бумагу помещают между стенкой пробирки и пробкой так, чтобы она не соприкаса­лась с засеянной средой. При выделении индола на 2—3-й день нижняя часть полоски бумаги, вследствие соединения индола со щавелевой кислотой, приобретает розовый цвет.

Наличие аммиака определяют по посинению розовой лакмусовой бумаги, помещенной между стенкой и пробкой пробирки.

Обнаружение сероводорода. В пробирку с по­севом подвешивают индикаторную полоску фильтровальной бумаги, пропитанную раствором уксуснокислого свинца. При взаимодействии сероводорода и уксуснокислого свинца бу­мага чернеет в результате образования сернистого свинца. - Определение каталазы. На поверхность 24-часо­вой агаровой культуры на косом агаре наливают 1—2 мл 1% раствора перекиси водорода. Появление пузырьков га­за регистрируется как положительная реакция. В качестве контроля следует параллельно исследовать культуру, за­ведомо содержащую каталазу.

С целью установления редуцирующей (восста­навливающей) способности используют метиле­новый синий, тионин, лакмус, индигокармин, нейтральный красный и др. К питательному бульону или агару прибав­ляют раствор одного из указанных красителей. При наличии у микроба редуцирующей способности среда обесцвечивает­ся. Наиболее часто используют среду Ротбергера (мясо-пеп­тонный агар с 1 % глюкозы и несколькими каплями насыщен^ ного раствора нейтрального красного). При положительной

83

перевиваемых тканях, в куриных эмбрионах и другими спосо­бами.

Видоизмененная среда Мейтлендов состоит из раствора Тироде (NaCl 8 г, КС1 0,2 г, СаС1₂ 0,2 г, MgCl₂ • 6Н₂0 0,1 г, NaH₂P0₄ • 4Н₂0 0,05 г, ЫаНСОз 1 г, дважды дистиллированная вода 1000 мл) и сыво­ротки морской свинки или кролика, рН 7,4—7,6. Готовую среду разли-п;пот по 4—5 мл во флаконы и вносят в них зараженную риккетсиями измельченную ткань влагалищной оболочки яичек морской свинки.

Тироде-сывороточную среду Цинссера готовят из смеси раствора Ти­роде, лошадиной сыворотки и 3% агара, рН 7,8. Среду разливают в про­бирки и скашивают. Ткань, зараженную риккетсиями, распределяют на скошенной поверхности агара.

реакции красный цвет агара переходит в желтый, желто-зе­леный, флюоресцирующий, при ферментации глюкозы по­являются разрывы среды.

Для идентификации малоизвестных микробов изучают их ферментативные свойства. С этой целью производят посевы в среды «пестрого» ряда, содержащие углеводы (моно-, ди-, полисахариды и многоатомные спирты), молоко, желатину, сыворотку и др., выявляют наличие каталазы, уреазы, ци-стиназы, а также гемолитические, редуцирующие и другие свойства. При работе с относительно известными микроба­ми в качестве ориентировочного исследования используют короткий «пестрый» ряд, который обычно состоит из сред с глюкозой, лактозой, молока и пептонной воды.

Ферментативные свойства анаэробных микробов изучают в средах «пестрого» ряда, разлитых высоким столбиком.

Задания

1. Выделение чистой культуры аэробных бактерий (3-й день): а) изучение характера роста на скошенном агаре; б) приготовление мазков, окраска по Граму и микроскопия (проверка чистоты выделенной культуры); в) посев выде­ленной культуры аэробных бактерий в короткий «пестрый» ряд.

2. Изучение ферментативных свойств микроорганизмов: а) ознакомление с сухими питательными средами Гисса, Плоскирева, Эндо, Левина; б) демонстрация сред «пестрого» ряда, измененных под влиянием роста Е. coli и сальмонелл брюшного тифа, разжиженной желатины, пептонизирован-ного молока.

3. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий; а) изучение посевов в среде Китта — Тароцци; б) приготов­ление мазков, окраска по Граму, микроскопия; в) посев в пробирки методом последовательного разведения.

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ВЫДЕЛЕНИЯ РИККЕТСИИ И ВИРУСОВ