Задания

1. Выделение чистой культуры бактерий из смеси микро­бов (1-й день): а) приготовление мазка, окраска по Граму и микроскопия; б) посев изучаемой смеси петлей в чашки Петри с мясо-пептонным агаром для разделения бактерий.

2. Ознакомление с устройством термостата и холодиль­ника.

Методы выделения чистых культур аэробных бактерий (продолжение). Культивирование и выделение чистой культуры анаэробных бактерий

Методы выделения чистой культуры аэробных бактерий

Выделение чистой культуры аэробных бактерий (2-й день). После суточного пребывания чашек с посевами в тер­мостате изучают культуральные свойства бактерий. Куль-

77

туральными свойствами микроорганизмов называется характер роста их на плотных и жидких питательных средах.

1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете. Чашку повора­чивают дном к себе и рассматривают колонии в проходя* щем свете.

При наличии двух различных видов колоний их нумеруют и описывают каждую в отдельности. В протоколе отмечают следующие данные: а) величина колоний (крупная — 4— 5 мм в диаметре и более, средняя — 2—4 мм, мелкая — 1—2 мм, карликовая — меньше 1 мм); б) форма очертаний колоний (правильно и неправильно округлая, розеткообраз-ная, ризоидная и др.); в) степень прозрачности (непрозрач­ная, полупрозрачная, прозрачная).

В отраженном свете рассматривают колонии со стороны крышки, не открывая ее, и отмечают: а) цвет колоний (бес­цветная, пигментированная, цвет пигмента); б) поверхность (гладкая, блестящая, влажная или морщинистая, матовая, сухая и др.); в) положение колонии на питательной среде (возвышающаяся над средой, погруженная в среду, на уров­не среды — плоская, плотно прилегающая к среде — упло­щенная).

2. Микроскопическое изучение колоний. Чашку устанавливают вверх дном на предметном столике микроскопа, опускают конденсор, освещают поле зрения зеркалом и объективом 8, изучают структуру и края коло­ний: а) характер краев (ровные, волнистые, зазубренные, бахромчатые и др.); б) структура колоний (гомогенная или аморфная, зернистая, волокнистая и др.).

Из части колонии готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии однородных бактерий оста­ток колоний пересевают на скошенный агар для получения в достаточном количестве чистой культуры. Пробирки с по­севами помещают в термостат на 18—24 часа при темпера­туре 37°.

Техника пересева колоний на скошенный агар: 1) дно чаш­ки с отмеченной колонией берут в левую руку, так же как для посева петлей; 2) петлю держат ближе к концу петле-держателя и фиксируют руку, опираясь мизинцем о борт чашки; 3) снимают петлей остаток отмеченной колонии, дно чашки вкладывают в крышку; 4) из штатива берут пробирку со скошенным агаром и, как описано выше, про­изводят посев.

78

терморегулятор обеспечивает постоянную температуру. По­севы помещают в анаэростат после того, как температура в нем будет доведена до 37°, и герметически закрывают дверку. Отросток крана на верхней стенке анаэростата сое­диняют с вакуум-насосом, после получения необходимого вакуума (3—5 мм) кран перекрывают, и посевы инкуби­руют в течение заданного времени (обычно 48 часов). В ана-аэростате культивируют микробы только на плотных пи­тательных средах.

Портативный анаэростат — это небольшой металлический цилиндр с герметически закрывающейся крышкой, на кото­рой имеется вакуумметр и два крана, соединяющихся с вакуум-насосом. Засеянные питательные среды устанавли­вают на подставке, затем создают вакуум и ставят прибор в термостат.

Аппарат Аристовского состоит из металлического цилинд­ра, диаметр которого соответствует размерам чашек Петри, крышки и специальной подставки. Для поглощения кисло­рода устанавливают две крышки чашек Петри (одну снизу и одну сверху) с увлажненной смесью двууглекислой соды и гидросульфита натрия, затем герметически закрытый аппа­рат с посевами ставят в термостат. При отсутствии аппарата Аристовского используют обычный эксикатор.

Выделение чистых культур анаэробных бактерий. В 1-й день исследуемый материал сеют в среду Китта-Тароцци градуированной или пастеровской пипеткой, затем посевы помещают в термостат.

На 2-й день учитывают изменения, наступившие в среде накопления: появление помутнения или помутнения и га­зообразования. Бульонную культуру набирают пастеров­ской пипеткой, которую опускают через слой вазелинового масла до дна пробирки. Масло с поверхности стенок пипет­ки удаляют стерильной ватой при помощи пинцета над со­судом с дезинфицирующим раствором. Мазки приготовля­ют на стекле обычным способом, фиксируют на пламени и окрашивают по Граму. При микроскопии регистрируют на­личие грамположительных палочковидных форм (со спо­рами или без спор) и делают пересев из среды накопления на плотные питательные среды. Изолированные колонии получают двумя способами.

1. Подготавливают 3 чашки с кровяно-сахарным агаром. Каплю среды с микробами наносят в 1-ю чашку, распреде­ляют ее по поверхности стеклянным шпателем. Этим же шпателем последовательно делают посев во 2-ю и 3-ю чаш-

80

Методы культивирования анаэробных бактерий

О дним из основных требований при культивировании шаэробных бактерий является удаление кислорода из пита­тельной среды. Условия пониженного давления кислорода создают различными способами: внутри питательной среды пли при помощи специальной аппаратуры. Жидкие среды используют для накопления бактерий; плотные, разлитые в чашки и разлитые высоким столбиком в пробирки,—с целью выделения чистых культур ан­аэробных микроорганизмов.

Из жидких питательных сред применяют среду Китта — Та- роцци (среду накопления), со- стоящую из концентрированно- го мясо-пептонного бульона, 1% глюкозы и 0,15% агара (рН 7,2—7,4). На дно пробирки помещают кусочки вареной пе- чени или фарша слоем в 1 — 1,5 см и заливают 6—7 мл сре- ды. Перед посевом среду «ре- генерируют» (кипятят 10 — 15 минут для удаления возду- ха) и затем быстро охлаждают, а после этого заливают стериль- ным вазелиновым маслом. Се- ют материал в две пробирки со р_ис 51 Анаэросгат. средой Китта — Тароцци, одну из них прогревают 30 минут

при 80° для уничтожения вегетативных форм сопутствующей микрофлоры. Кроме среды Китта — Тароцци, используют бульон Хоттингера и Мартена с 0,5—1% глюкозы и кусочка­ми животной ткани. Анаэробные условия создаются так же, как описано выше.

Посевы на плотных средах, разлитых в чашки Петри, культивируют в стационарном, портативном анаэростате или в аппарате Аристовского.

Стационарный анаэростат (рис. 51) представляет собой прямоугольный двустенный аппарат с герметически закры­вающейся застекленной дверкой. Между стенками аппара­та находится вода, источником тепла служит электричество,

79

КИ, которые помещают в анаэростат или другие приборы при 37° на 24—48 часов (метод Цейсслера).

2. Изолированные колонии анаэробных микробов получа­ют в глубине плотной питательной среды (метод последо­вательных разведений Вейнберга). Культуру из среды берут пастеровской пипеткой с запаянным концом и переносят по­следовательно в 1-ю, 2-ю и 3-ю пробирки с 10 мл 0,85% рас­твора поваренной соли. Затем продолжают производить разведения, перенося материал в 4-ю, 5-ю и 6-ю пробирки (из тонкого стекла диаметром 0,8 см и высотой 18 см) с расплавленным и остуженным до 50° мясо-пептонным ага­ром. После остывания агара посевы помещают в термостат.

На 3-й день изучают образовавшиеся изолированные ко­лонии в чашках, из более типичных делают мазки. Остаток их сеют в среду Китта — Тароцци. Колонии из пробирок извлекают стерильной пастеровской пипеткой или столбик агара выталкивают при подогревании дна пробирки. Из части материала приготовляют мазки, а остаток его сеют в среду Китта — Тароцци для получения чистой культуры, которую затем идентифицируют.

Задания

1. Выделение чистых культур аэробных бактерий (2-й день): а) изучение колоний в чашках с мясо-пептонным ага­ром; б) приготовление мазков из отмеченных колоний, окрас­ка по Граму и микроскопия; в) отсев изученных колоний на скошенный агар для накопления чистых культур; г) демон­страция пигментных и светящихся бактерий.

2. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий (1-й день); а) изучение аппаратуры для выращивания анаэроб­ных бактерий; б) посев почвы в среду Китта — Тароцци для обнаружения анаэробных клостридий.