Задания

1. Приготовление толстой капли и мазков крови, окраска но Романовскому — Гимзе.

2. Демонстрация окрашенных мазков с возбудителями амебиаза, малярии, лейшманиоза, трипаносомоза, лямблио-за, токсоплазмоза (зарисовка).

Лямблии (Lamblia) по форме напоминают грушу (рис. 35), передний конец широкий, закругленный, хвосто­вой конец узкий, заостренный. Паразит имеет четыре пары жгутиков и обладает очень активной подвижностью. Он при­сасывается к стенкам кишечника при помощи сосущего дис­ка (перистом). Вегетативные формы лямблий имеют ядра и цисты (2 или 4). Ядра легко обнаруживаются при обработке препарата раствором Люголя.

Плазмодии малярии (Plasmodium) изучают в мазках крови, окрашенных по Романовскому — Гимзе.

Морфология плазмодиев меняется в зависимости от вида и цикла их развития. Например, мерозоит Plasmodium vi-vax, проникнув в эритроцит, принимает форму кольца (мо­лодой шизонт). На розовом фоне эритроцита отчетливо вы­деляется голубая цитоплазма паразита с рубиново-красным ядром и вакуолью в центре. Затем паразит растет, превра­щается во взрослого шизонта и приобретает подвижность. В стадии меруляции появляются от 12 до 20 мерозоитов, располагающихся в виде тутовой ягоды. Наряду с шизонта-

52

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изучение микроорганизмов проводят в комплексе морфо­логических, физико-химических и физиологических свойств, так как структура и функции живых существ тесно связаны между собой. В приготовлении питательных сред и культи­вировании микробов большое значение имеет овладение це­лым рядом методов, с помощью которых осуществляют сте­рилизацию, выделение чистых культур, изучение их фермен­тативных свойств. Особенно сложными являются способы культивирования вирусов, которые в отличие от бактерий нуждаются в специальных условиях (наличие живых и раз­множающихся клеток тканей или органов животных и птиц). В лабораторной диагностике инфекционных болезней бес­спорную роль играет и такой важный фактор, как изменчи­вость микроорганизмов под влиянием физических, химиче­ских и биологических факторов.

МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ И ИЗУЧЕНИЕ АППАРАТУРЫ. ПИТАНИЕ И РАЗМНОЖЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОСНОВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Методы стерилизации

Стерилизация — полное уничтожение всех микробов с по­мощью высокой температуры. >

Известны различные способы использования высокой температуры.

Стерилизация в пламени. Этот способ приме­няется для стерилизации бактериологических петель, игл, предметных и покровных стекол, пинцетов и других мелких металлических и стеклянных предметов.

Стерилизация кипячением используется для обработки игл, шприцев, хирургических инструментов. Ки­пятят их в специальных стерилизаторах в течение 30 минут. Для повышения точки кипения и устранения жесткости во-

54

Современные автоклавы расположены горизонтально (рис. 38). Рабочая камера получает пар от маленького кот­ла, помещенного под камерой и соединенного с ней патруб­ком. Воду в котел наливают через воронку, соединенную с указательной трубкой, нагревают электрическим током от

с ети. Электронагревательный эле­мент снабжен регулятором тем­пературы. Давление измеряют манометром. На шкале маномет­ра обозначается только избыточ­ное давление, нормальное соот­ветствует нулю («О»). Работа с автоклавом требует строгого вы­полнения правил, изложенных в специальной инструкции, прила­гаемой к каждому аппарату.

В автоклаве стерилизуют при 120° в течение 15 минут обычные питательные среды (мясо-пептон-ный агар, мясо-пептонный буль­он), 0,85% раствор хлористого натрия, лабораторную посуду с заразным материалом. При этой температуре нельзя стерилизо­вать среды с нативными белками, углеводами и другими легко из­меняющимися от нагревания ве­ществами. Среды с углеводами стерилизуют при 110° в течение 5—10 минут. Обеззараживание материала и посуды, содержащих бациллы сибирской язвы, кло-стридии ботулизма, производят при 120° в течение 1—1¹ /₂ ча­сов, а при 134° — в течение 40 минут.

Для контроля работы автоклава между стерилизуемыми предметами кладут стеклянную запаянную трубку с вещест­вом, имеющим определенную точку плавления (бензонаф­тол — 110°, бензойная кислота — 120° и др.), с небольшим количеством сухого анилинового красителя. При расплав­лении этих веществ происходит равномерное окрашива­ние их.

Эффективность стерилизации проверяют, помещая в авто­клав материал, заведомо зараженный спорами бацилл. Пар под давлением обладает весьма большой приникающей спо-

56

ды добавляют 1 % соды. Этот метод не обеспечивает полной стерилизации, так как споры некоторых бацилл и клостри-лий выдерживают кипячение в течение нескольких часов.

С терилизация горячим воздухом проводит­ся в печах Пастера (металлические двустенные шкафы, изо­лированные асбестом или линолеумом, с отверстием в верхней части для термомет­ра). Источником высокой температуры служат элек­трическая энергия, газовые горелки, примусы. В настоя­щее время электрические аппараты для стерилизации горячим воздухом имеют ци­линдрическую форму (рис. 36), снабжены хорошей теп­ловой изоляцией. Необходи­мая температура автомати­чески поддерживается тер­морегулятором, работу ко­торого можно наблюдать с помощью контрольной лам­пы. В печах Пастера стери­лизуют лабораторную посу­ду при 160° в течение Р/2 ча­сов, в вирусологических ла­бораториях— при 180° в те­чение часа. Предварительно посуду тщательно моют и высушивают. Чашки Петри укладывают в специальные

металлические пеналы, чаще

обертывают в бумагу по одной или несколько штук в пачке. Пастеровские и градуированные пипетки закрывают с одного конца ватой и помещают в металлические пеналы или завертывают в бумагу по 10—15 штук. Пробирки и кол­бы закрывают ватными пробками. Посуду после окончания стерилизации извлекают только после охлаждения.

Стерилизацию паром проводят двумя способами: насыщенным паром под давлением в автоклаве и текучим паром.

Автоклав (рис. 37) представляет собой толстостенный ко» тел цилиндрической формы, покрытый снаружи кожухом и герметически закрывающийся крышкой.

55

собностыо, поэтому стерилизация в автоклаве является наи­более совершенной, обеспечивающей гибель спор.

Стерилизация текучим паром проводится троекратно (дробно) в течение 3 дней по 30-60 минут. Обычно исполь­зуют аппарат Коха (рис. 39), который представляет собой

Рис. 38. Автоклав горизонтальный. Рис. 39. Аппарат Коха для сте­рилизации текучим паром.

металлический цилиндр, покрытый теплоизоляционным ма­териалом. В конической крышке аппарата находится отвер­стие для выхода пара, в нижней части — кран и указательная трубка. Внутри аппарата имеется подставка для стерилизуе­мых материалов, до половины высоты которой наливают воду. Подогрев воды производят любым источником тепла. В аппарате Коха стерилизуют питательные среды, изменяю­щие свои свойства при более высокой температуре: молоко, желатину, картофель и среды с углеводами. Вегетативные формы микробов при такой стерилизации погибают, а споры

57

сохраняйся й в условиях комнатной температуры, черей сутки они прорастают; повторное воздействие паром снова обезвреживает вегетативные формы. Третье прогревание убивает все остальные бациллы и клостридий, развившиеся из спор. Стерилизовать текучим паром можно в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране.

Свертывание (уплотнение) сыворотки и яичных сред производят в специальном двустенном свертывателе Коха (рис. 40) с электрическим нагревом. Аппарат покрыт тепло­изоляционным материалом и имеет две крышки, первую стеклянную и вторую металлическую. Воду наливают через отверстие в верхней части, закрывающееся пробкой, с встав­ленным в нее термометром. Пробирки со средами уклады­вают на дно свертывателя в наклонном положении. Прогре­вают среды однократно при температуре 80—90° в течение часа. Если предполагается наличие микробов в сыворотке, то ее стерилизуют дробно 3 дня подряд при 80° в продолже­ние 1У₂—2 часов.

Тиндализация — дробная стерилизация, предложен­ная Тиндалем для веществ, легко разрушающихся и денату­рирующихся при температуре 60° (сыворотки, витамины). Нагревание производят повторно в течение 5—6 дней в спе­циальных приборах с терморегуляторами или в обычных во­дяных банях при температуре 56—58° по часу.

58

Пастеризация (частичная стерилизация) была пред­ложена Пастером и направлена на уничтожение бесспоро­вых форм микробов, преимущественно патогенных видов, споры же сохраняются жизнеспособными. При пастеризации обезвреживают различные продукты однократным нагрева­нием при 65—70° в течение часа или при 70—80° 5—10 ми-

нут. Молоко пастеризуют с целью освобождения его от мо­лочнокислых и патогенных бактерий (туберкулезных, брюш­нотифозных, дизентерийных, стафилококков и др.). При па­стеризации пива, вина, плодовых соков уничтожаются мик­робы, вызывающие уксуснокислое и другие виды брожений этих напитков, при этом витамины не разрушаются и вкусо­вые качества продуктов сохраняются. Пастеризованные про­дукты необходимо хранить на холоде.

Фильтрование. Жидкости (питательные среды и другие растворы), которые нельзя подвергать действию вы­сокой температуры, стерилизуют методом фильтрации. В производственных и научно-исследовательских микробио-

59

.

логических лабораториях этим способом отделяют бактерии от экзотоксинов, фагов и вирусов.

Для этой цели из асбеста, керамики, стекла и других ма­териалов изготовляют мелкопористые (размер пор до 1 т\х) ультрафильтры. С помощью коллодийных и мембранных фильтров с точно градуированными порами определяют раз­меры фильтруемых частиц.

В микробиологической практи­ке используют фильтры Зейтца (рис.41),свечи Беркефельда (рис. 42) и Шамберлана (рис. 43).

Фильтры Зейтца состоят из двух частей: металлического полого ци- линдра и нижней опорной части, заканчивающейся трубкой. На опорную сетку кладут асбестовую пластинку, выполняющую функ- цию фильтра, диаметром 33 мм Рис. 43. Свеча Шамбер- (_для производственных целей ис- , . ^лана* „ пользуют пластинки больших раз-

/ —фильтруемая жидкость; 2— \ гл* "

фильтровальная свеча. МерОВ) . UOe ЧаСТИ СОеДИНЯЮТ ВИН-

тами. Смонтированный фильтр вставляют в резиновую пробку колбы с боковым отрост­ком. Подготовленный фильтр обертывают в бумагу и стерилизуют в автоклаве. Жидкость наливают в цилиндр и соединяют боковой отросток колбы с вакуум-насосом. Фильтрование можно проводить также при положительном давлении. С этой целью цилиндр с фильтруемой жидкостью закрывают резиновой пробкой, в отверстие которой встав­лена резиновая трубка, соединяющая фильтр с нагнетаю­щим насосом.

Для некоторых работ применяют мембранные фильтры, диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм. Они изготовляются из нитроклетчатки и имеют определенные размеры пор (от 350 m\i — фильтр № 1 до 1200 — фильтр № 5).

Мембранные фильтры перед употреблением стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 20 минут и укладывают на опорную сетку блестящей поверхностью вниз. Под мембранный фильтр и на него помещают кольца из тонкой резины и кружки из фильтровальной бумаги. Ме­таллические детали фильтра стерилизуют заранее и монти­руют в асептических условиях.

Фильтры^ (свечи) Шамберлана и Беркефельда представ­ляют собой полые цилиндры, закрытые с одного конца и

60

напоминающие свечу. Фильтры Шамберлана изготовляют из каолина с примесью песка и кварца. Стандартизуются они по размерам пор и нумеруются L_b L₂, L₃... Li₃. Фильтры Бер­кефельда готовят из инфузорной земли, по величине пор они обозначаются буквами V, N, W.

Бактерицидными свойствами обладают ионизирующая ра­диация и ультразвук, которые могут быть использованы для стерилизации пищевых продуктов, питательных сред, биоло­гических препаратов (вакцины, сыворотки и др.) и дезин­фекции предметов (см. стр. 93).

Питательные среды

Питательные среды должны содержать основные вещест­ва, обеспечивающие оптимальный рост микроорганизмов (азот, углерод, кислород, водород, различные соли, микро­элементы, витамины — факторы роста), иметь соответствую­щую реакцию (рН), быть изотоничными, стерильными, а также обладать определенным окислительно-восстанови­тельным потенциалом (гН₂) и вязкостью.

Питательные среды приготовляют из продуктов раститель­ного и животного происхождения (картофель, морковь, мя­со, кровь, сыворотка, молоко, яйца). В состав синтетических сред входят различные химически чистые соединения (ами­нокислоты, соли, ряд витаминов и др.).

По консистенции питательные среды делят на жидкие, по­лужидкие и плотные. К жидким питательным средам при­надлежат мясо-пептонный, сахарный, кровяной и желчный бульон, пептонная вода, молоко и др. Полужидкие среды со­держат 0,15—0,5% агар-агара. Плотными средами являют­ся мясо-пептонный агар (2—4% агара), мясо-пептонная желатина (10—15% желатины), свернутая сыворотка, свер­нутый яичный желток.

Питательные среды подразделяют на: 1) простые, или обычные, 2) специальные, к которым принадлежат электив­ные (избирательные), 3) дифференциально-диагностические среды.

1. Простые, или обычные, среды. К ним относят мясо-пеп­тонный бульон и мясо-пептонный агар. На этих средах культивируют большинство патогенных и сапрофитных мик­робов: пастереллы чумы, бациллы сибирской язвы, Е. coli и др.

2. Специальные среды служат для выращивания микроор­ганизмов, не растущих на простых питательных средах. На

61

кровяном, сывороточном и сахарном агаре и бульоне куль­тивируют стрептококки, пневмококки и др., на желточных средах — возбудитель туляремии.

Элективные, или избирательные, среды применяют для выращивания определенного вида бактерий, в то время как размножение других видов микробов задер­живается.

На щелочной пептонной воде с рН 7,8—8.2 довольно быст­ро развивается холерный вибрион. Для тифозно-паратифоз-ных и дизентерийных бактерий элективными средами явля­ются желчный бульон и плотные среды с желчными солями; дифтерийные коринебактерии хорошо растут на свернутой сыворотке.

К числу специальных питательных сред принадлежат и синтетические. Так, например, среда Сотона приме­няется для культивирования туберкулезных микобактерий. Имеются синтетические среды для выращивания пастерелл чумы, пневмококков, дифтерийных и других бактерий.

3. Дифференциально-диагностические среды с углеводами, белками и красителями дают возможность выявить различ­ные ферменты, которые определяют ферментативные свой­ства бактерий.

Приготовление обычных питательных сред. Основой для приготовления этих сред служит мясная вода, содержащая экстрактивные вещества.

Посуда. Питательные среды готовят в эмалированных кастрюлях или из нержавеющей стали. Готовые питательные среды разливают во флаконы, пробирки, чашки.

Новую стеклянную посуду кипятят в 1—2% растворе соляной кис­лоты для нейтрализации растворимой щелочи, затем тщательно промы­вают в проточной воде и сушат. Посуду, бывшую в употреблении, сте­рилизуют, затем моют в мыльном или содовом растворе еошом, хорошо прополаскивают и сушат. Сухие флаконы, колбы, пробирки закрывают ватными пробками.

Мясная вода. 1. 500 г свежей говядины или теляти-ны, освобожденной от костей, жира и сухожилий, пропуска­ют через мясорубку, фарш заливают 1 л водопроводной во-воды, хорошо размешивают. Оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 часа в термостат при 37°.

• 2. Мясной настой отжимают через марлю, кипятят в те­чение 5 минут для свертывания белков, дают остыть. Фильт­руют через ватный фильтр, доливают водой до первоначаль­ного объема.

62

панкреатин в количестве 0,5—1% или поджелудочную же­лезу из расчета 100 г железы на 1 л жидкости. Затем смесь снова подщелачивают до рН 8 и разливают ее в бутыль. Туда же добавляют 2—3% хлороформа и, закрыв бутыль резиновой пробкой, несколько раз встряхивают содержимое. Бутыль ставят на 7—14 суток при температуре 37°.

В результате переваривания мясной фарш превращается в гомогенный сероватый осадок, над которым находится со­вершенно прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета. Перевар Хоттингера хорошего качества дает положитель­ную реакцию на триптофан и содержит 560—860 мг% амин-ного азота. Для приготовления бульона к 1 части перевара прибавляют 6—7 частей воды.

Мясо-пептонный бульон (МПБ). 1. В 1 л мяс­ной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г пептона (1%) и 5 г (0,5%) хлористого натрия. Рекоменду­ется брать 3 части хлористого натрия и 2 части двузамещен-ного фосфорнокислого натрия. Смесь вводится в количестве 0,5%. Фосфорнокислый натрий стабилизирует реакцию сре* ды и служит дополнительным источником фосфора. Уста­навливают рН среды до 7,6—7,8, кипятят 30—45 минут до выпадения осадка.

2. Охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, доли­вают водой до первоначального объема, проверяют рН.

3. Разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют 15— 20 минут в автоклаве при 120°.

Концентрированный мясо-пептонный бульон готовят на особой мясной воде (1 кг мяса заливают 1 л воды). Такой бульон служит для выращивания анаэробных и других мик­робов.

М я с о-п ептонный агар (МПА). 1. К мясо-пептон-ному бульону для придания плотности добавляют 2—2,5% мелко нарезанного и промытого агар-агара К

2. Кипятят, помешивая до полного расплавления агара. В некоторых случаях для просветления среды прибавляют белок одного куриного яйца, смешанного с двойным коли­чеством холодной воды. Среду помещают в автоклав на 45 минут при 115°. Свернувшиеся хлопья белка адсорбируют взвешенные частицы и осаждаются на дно.

¹ Агар-агар получают путем специальной обработки морских водо­рослей. Он является веществом полисахаридной природы, содержит незначительное количество азота и не представляет собой питательный субстрат. Студень, образуемый агар-агаром, расплавляется при 70— 100° и застывает при 40—50°.

64

3. Мясную воду разливают во флаконы, стерилизуют "О—30 минут при 120° и сохраняют в темном месте. Она имеет вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции (рН 6,2—6,4), без белков. В мясной воде содержит­ся небольшое количество аминокислот, солей, углеводов, факторов роста и экстрактивных веществ. Для приготовле­ния обычных питательных сред к мясной воде прибавляют сухой пептон, который является перв.ичным продуктом гид­ролиза белка и состоит из смеси альбумоз, полипептидов и аминокислот, полученных путем пептического или триптиче-ского переваривания.

На мясокомбинатах для производства сухого пептона ис­пользуют фибрин, кровь и другие отходы. Сушат пептон в распылительной вакуум-сушилке.

Жидкий пептон можно приготовить в лабораторных усло­виях путем пептического переваривания белков.

Пептон Мартена. Свиные желудки (не промытые водой) с обильным слизистым слоем очищают от пленок, жира и пропускают через мясорубку. К фаршу прибавляют воду и соляную кислоту в следующем соотношении: фарш из свиных желудков 250 г, вода водопроводная, нагретая до 50°, 1000 мл, соляная кислота (удельный вес 1,18) 10 мл. Смесь выдерживают в термостате при 50°. Через 24 часа пептон прогревают в автоклаве при 100° и фильтруют, фильтрат подщелачивают 10% раствором NaOH до щелоч­ной реакции по лакмусу. После этого фильтрат разливают в колбы и стерилизуют при 115° 30 минут.

Для приготовления бульона пептон Мартена смешивают с равным объемом мясной воды, устанавливают необходи­мую реакцию, кипятят 30 минут, фильтруют и стерилизуют при 115° 30 минут.

Мясо можно переваривать с помощью трипсина — пере­вар Хоттингера, при этом более полно используют белки мя­са, которые расщепляются до пептонов, полипептидов и сво­бодных аминокислот. При триптическом переваривании мя-са получают в 10 раз больше бульона, чем при обычном методе.

Мясной перевар Хоттингера. Мясо, освобож­денное от жира и сухожилий, нарезают небольшими кусоч­ками, помещают в кастрюлю с кипящей водопроводной во­дой (в полуторном объеме) и кипятят 15—20 минут, затем мясо извлекают из жидкости и пропускают через мясорубку. Установив рН охлажденной до 40—45° жидкости, равный 3, ею заливают фарш. К полученной смеси добавляют сухой

63

3. П роверяют и исправляют реакцию среды. Отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем авто­клаве или в специальной металлической воронке с двойными стенками, между которыми находится горячая вода.

4. Разливают среду через стеклянную воронку с зажимом в пробирки и флаконы и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 15—20 минут.

5. Из расплавленного стерильного мясо-пептонного агара приготовляют скошенный и прямой агар (агар столбиком). В первом случае пробирки укладывают горизонтально до полного застывания, во втором — пробирки помещают в штатив вертикально.

В настоящее время бактериологические лаборатории ши­роко используют сухие питательные среды в ви­де порошков, хранящихся в герметически закрытых банках. Кроме обычных питательных сред (МПБ и МПА), имеются специальные и дифференциально-диагностические среды. Го­товят среды по прописи, указанной на этикетке, навеску порошка растворяют в определенном объеме дистиллирован­ной воды, среду разливают в пробирки и стерилизуют при соответствующей температуре. Постоянство состава, стан­дартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуще­ством сухих питательных сред.

Определение рН (концентрации водородных ионов) питательной среды производят колориметрическим методом. Известно, что дистиллированная вода имеет рН 7 (отрица­тельный логарифм числа водородных ионов). Выше идут по­казатели щелочной реакции, ниже 7 —показатели кислой

65

реакции. Для определения рН по методу Михаэлиса имеют­ся наборы стандартов от рН 5,4 до рН 8,4, индикаторы — 0,1% раствор паранитрофенола, 0,3% раствор метанитрофе* нола и компаратор.

Определение рН производится в компараторе (рис. 44) — специальном штативе с 6 гнездами. В этих гнездах разме­щают пробирки в определенном порядке. Во 2-е гнездо ста­вят пробирку с 2 мл испытуемой среды, 4 мл дистиллирован­ной воды и 1 мл индикатора, рядом в 1-е и 3-е — такие же пробирки и наливают в них по 2 мл испытуемой среды и 5 мл дистиллированной воды. В 5-е гнездо помещают про­бирку с дистиллированной водой, в 4-е и 6-е — стандарты с показателями, близкими заданной реакции. Например, не­обходимо установить реакцию рН 7,4. В 4-е гнездо ставят стандартную пробирку с рН 7,2, а в 6-е — с рН 7,4. Желто­ватый цвет среды при описанном размещении пробирок компенсируется тем, что между пробирками со стандартом и источником света устанавливают пробирку, в которой на­лита среда без индикатора. Пробирку рассматривают на свет через нижние отверстия компаратора на фоне голубой пластинки. Если в приведенном примере цвет исследуемой среды совпадает с цветом стандарта рН 7,2, а необходимо приготовить среду с цветом стандарта рН 7,4, то ко второй пробирке (см. рис. 44, 3), содержащей 2 мл испытуемой среды и индикатор, микропипеткой прибавляют N/20 раство­ра NaOH (4% раствор NaOH, разведенный в 20 раз) до тех пор, пока цвет содержимого этой пробирки совпадет со стандартом рН 7,4. Так, для 2 мл среды потребовалось 0,32 мл N/20 NaOH. Для приготовления 1000 мл среды не­обходимо произвести расчет по уравнению:

2-0,32. 0,32.1 000 __1в0

ЮОО —х ' ^Х" ~2~ '

т. е. к 1 л питательной среды нужно прибавить 160 мл N/20 раствора или 8 мл нормального раствора щелочи. Этот спо­соб дает возможность установить рН больших количеств питательной среды.

Для определения рН плотных питательных сред их рас­плавляют и наливают в пробирки компаратора горячую дистиллированную воду. После установления соответствую­щего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.

66

При наличии роста в контрольных пробирках, остальные прогревают повторно 2 дня по 2 часа при температуре 80°.

б) В тех случаях, когда сыворотка готовится из крови, полученной на бойне, кровь стерильно берут венепункцией или собирают ее при убое животного в стерильные бутыли (первые порции крови не используют). Перед стерилиза­цией в бутыли наливают 20—30 мл 0,85% раствора NaCl и перед взятием смачивают стенки бутыли, чтобы сгусток крови не прилипал к ним. Кровь помещают на 2—3 часа в термостат, после ее свертывания отделяют сгусток от стенок бутылей стеклянной палочкой или пипеткой и перено­сят на холод. Через сутки отделившуюся сыворотку отса­сывают и для консервирования добавляют 0,5% хлорофор­ма. С целью проверки сыворотки на пригодность роста диф­терийных коринебактерий готовят несколько пробирок с питательной средой и засевают в них не менее 3 свежевы-деленных культур. Годными для работы считают те сыво­ротки, на которых наблюдается через 24 часа хороший рост дифтерийных коринебактерий типичной морфологии.

4. Желчный бульон. К мясо-пептонному бульону рН 7,4 прибавляют 10% бычьей желчи. Среду разливают в пробирки и флаконы, стерилизуют в течение 15 минут при 120°. Эта среда является элективной для тифозно-парати-фозных и дизентерийных бактерий.

5. Пептонная вода. К 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 5 г NaCl, кипятят, после охлажде­ния устанавливают рН среды, равный 8—8,2. Пептонную воду разливают в пробирки и флаконы, стерилизуют в те­чение 15 минут при 120°. Пептонную воду используют для выращивания холерного вибриона.

В настоящее время нередко применяют селективные (см. стр. 286) питательные среды, на которых подавляется рост сопутствующей микрофлоры. Для их приготовления в питательные среды вводят определенные концентрации ан­тибиотиков. Так, например, для выделения чистой культуры гриба рода Candida при исследовании материала, содер­жащего постороннюю микрофлору, к 15—20 мл питательной среды добавляют 300—400 единиц стрептомицина.

I Желатина представляет собой вещество белковой природы. Изго­товляется о^а из^остей, хрящей и отходов нжур телят. Точка плавле-I[пя 10% желатины 32—34°.

Синтетические питательные среды содержат различные химически чистые соединения в точно определенных количе­ствах, растворенные в дважды дистиллированной воде. При­менение таких сред позволяет определять потребность изу­чаемого вида микроба в тех или иных веществах, а также изучить механизмы образования токсинов, антибиотиков и

68

Для более точного определения рН используют электро­метрический метод с помощью потенциометра.

Приготовление специальных питательных сред. 1. Мясо-|| <' птонны й бульон и м я с о-п е п т о н н ы й агар с глюкозой и другими компонентами. Для приго- пиления сахарного бульона и агара к мясо-пептонному <»\.1ьону или расплавленному мясо-пептонному агару при-п;шляют от 0,5 до 1% глюкозы. «Сахарные» среды стерили-tyioT текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или под дав­лением 0,4 атм. при 110° в течение 10—15 минут. Для вы­ращивания стрептококков и некоторых других бактерий «сахарные» среды приготовляют ex tempore. К стерильному мясо-пептонному бульону или агару прибавляют свежепри­готовленный, прокипяченный 10% раствор глюкозы в ди­стиллированной воде. К 5 мл среды добавляют 0,5 мл рас­твора глюкозы. Для контроля стерильности бульон ставят в термостат на 24 часа при 37°.

Бульон с 2—5% глицерина готовят аналогично мясо-пеп­тонному бульону с глюкозой, в нем культивируют туберку­лезные и другие бактерии.

2. Агар с кровью, сывороткой или с асцит и-ческой жидкостью. К стерильному расплавленному и охлажденному до 45° мясо-пептонному агару, разлитому в пробирки и флаконы, прибавляют от 5 до 10% дефибрини-рованной крови, 20—25% асцитической жидкости или сы­воротки крови. Агар в пробирках тщательно перемешивают и скашивают, а содержимое флаконов разливают в чашки Петри. К стерильному бульону добавляют в таких же ко­личествах, как и к агару, кровь, асцитическую жидкость пли сыворотку крови. Указанные среды после контроля на стерильность используют для выращивания патогенных кок­ков (стрептококки, пневмококки) и других бактерий, в ас-цитическом агаре и бульоне культивируют главным образом менингококки и гонококки.

3. Приготовление свернутой сыворотки, а) Эту среду готовят из нормальной лошадиной или бычьей сыворотки. Сыворотку стерильно разливают в стерильные пробирки по 3 мл. Пробирки в наклонном положении укла­дывают в один ряд в аппарате для свертывания, подогре­вая до 50°. Температуру постепенно доводят до 80°, держат ее на этом уровне час, а затем среду вынимают и охлаж­дают при комнатной температуре. Свернутая сыворотка должна обязательно содержать конденсационную воду. Сре­ду контролируют выборочно на стерильность в термостате.

67

другие свойства микроорганизмов. В практических лабора­ториях широко используют синтетическую среду Сотона для культивирования микобактерий туберкулеза (см. стр. 245) и др.

Приготовление дифференциально-диагностических пита­тельных сред. Дифференциально-диагностические среды ис­пользуют для выявления протеолитических, сахаролитиче-ских, гемолитических и других свойств микробов.

На плотных дифференциально-диагностических средах (Плоскирева, Эндо и Левина) выделяют чистую культуру возбудителей кишечных заболеваний.

Протеолитические свойства микробов изучают на мясо-пептонной желатине, свернутой сыворотке (см. выше) и мо­локе. Наличие индола, сероводорода и аммиака выявляют в мясо-пептонном бульоне или пептонной воде специальны­ми индикаторами.

Мясо-пептонная желатина. К мясо-пептонному бульону добавляют 10—15% мелко нарезанной желатины¹, после набухания ее нагревают до полного расплавления и устанавливают рН 7—7,1. Среду осветляют белком. К 1 л прибавляют один яичный белок, смешанный с двумя объема­ми воды, взбалтывают и прогревают текучим паром в тече­ние 20 минут, фильтруют в горячем виде, проверяют рН и разливают в пробирки или другую посуду.- Среду стерили­зуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут и помещают в термостат для проверки стерильности. Исследуемую куль­туру бактерий сеют уколом в столбик желатины, посевы ос­тавляют на несколько дней при комнатной температуре и учитывают характер разжижения.

Молоко относится к естественным питательным средам. Свежеполученное молоко обезжиривают, разливают в про­бирки и стерилизуют текучим паром или при 110° в тече­ние 30 минут. Используют его с целью выявления протео­литических свойств и определения ферментации лактозы (в этом случае добавляют различные индикаторы).

Среды Гисса служат для определения ферментов, рас­щепляющих углеводы. В настоящее время сухие среды с углеводами готовят фабричным способом. Они состоят из питательного агара, углевода и индикатора BP (смесь вод­ного голубого красителя с розоловой кислотой). Из сухого порошка приготовляют полужидкие среды: 2 г порошка рас­творяют при

порошка приготовляют полужидкие среды: 2 г порошка рас­творяют при подогревании в 100 мл дистиллированной во­ды и доводят до кипения, разливают в стерильные пробирки, стерилизуют 10 минут при 110° или текучим паром. Среда имеет цвет мясо-пептонного агара. Индикатор BP в кислой среде приобретает синий цвет, в щелочной — красный, в нейтральной обесцвечивается. В некоторых случаях готовят жидкие среды Гисса. Основой для этих сред служит 1 % пеп-тонная вода, рН 7, в которую добавляют 0,5% определен­ного углевода, индикатора бромтимолблау или реактива Андреде ¹ и др. Для улавливания газа на дно пробирки по­мещают поплавки (стеклянные трубки, запаянные сверху). Стерилизуют среды Гисса при 110° в течение 10 минут или текучим паром в течение 30 минут 3 дня подряд.

При ферментации углеводов с образованием кислоты и газа наблюдается изменение цвета среды, выделяемый газ в полужидкой среде распределяется в виде пузырьков, а в жидкой среде улавливается поплавками.

Для выделения чистой культуры возбудителей кишечных заболеваний и их дифференциации с Е. coli раньше исполь­зовали среды Эндо и Левина, а в настоящее время применя­ют среду Плоскирева.

а) Среду Эндо, выпускают в сухом виде, готовят ее по прописи, указанной на этикетке: 5 г порошка растворяют при подогревании в 100 мл дистиллированной воды, кипя­тят 2—3 минуты при постоянном помешивании и разливают в чашки.

При отсутствии сухой среды Эндо она может быть при­готовлена ex tempore. К 100 мл стерильного расплавленного слабо щелочного мясо-пептонного агара добавляют 1 г лак­тозы, растворенной и прокипяченной в 5 мл дистиллирован­ной воды, и 1 мл насыщенного спиртового раствора основ­ного фуксина, обесцвеченного перед добавлением к агару 10% водным раствором сульфита натрия, при этом обра­зуется бесцветная фуксин-сернистая кислота. Среду смеши­вают, разливают по чашкам и подсушивают в термостате.

Кишечная палочка ферментирует лактозу с образованием альдегидов и фуксин-сернистая кислота переходит в альде­гид-сернистое соединение с освобождением фуксина, кото­рый окрашивает колонии в красный цвет с металлическим блеском.

70