Раздел IV. Обмен азотсодержащих соединений.

 

Тема 4.2. Общие пути обмена аминокислот.

 

Количественное определение аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрасферазы в сыворотке крови.

Аспартатаминотрансфераза(АсАТ) и аланинаминотрансфераза(АлАТ)- пиродоксальфосфатсодержащие ферменты.

АсСТ катализирует обратимый перенос аминогруппы от аспартата на α-кетоглурат с образованием глутамата и оксалоацетата.

АлАТ катализирует обратимую реакцию переноса аминогруппы от аланина на α-кетоглурат с образованием глутамата и пирувата(ПВК).

АлАТ содержиться в цитозоле, тогда как для АсАТ известны две формы: цитоплазматическая и митохондриальная.

При поражении тканей аминотрансферазы «вымываются» из поврежденных клеток в кровоток, поэтому определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет важное значение, особенно для диагностики поражений сердца и дифференциальной диагностики болезней печени. Так, при неосложненном инфаркте миокарда уровень АсАТ в сыворотке крови начинает повышаться уже через 4-6 ч. после наступления инфаркта, максимум активности приходиться на вторые сутки и лишь на 5-8-й день активность фермента снижается до нормы. Изменение активности сывороточной АлАТ при этом незначительно.

При инфекционном гепатите (болезни Боткина) и обострении хронического гепатита активности обоих аминотрансфераз в сыворотке крови повышаются (активность АлАТ повышается сильнее). Цирроз печени не сопровождается значительной гиперферментемией.

Цель работы. Определить активность обеих аминотрансфераз в сыворотке крови колориметрическим методом и сравнить полученные результаты с нормой.

Принцип метода. Определение активности обеих трансфераз основано на колориметрическом обнаружении пирувата, образующегося за 1ч инкубации, по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде. В случае АлАТ пируват образуется непосредственно из аланина, а в случае АсАТ пируват образуется из оксалоацетата после декарбоксилирования последнего в щелочной среде:

Аспартат + α-Кетоглурат↔ Глутамат + Оксалоацетат

Пируват СО₂

Активность обоих ферментов определяют по калибровочному графику.

 

 

Ход определения.

№	Реактивы и этапы	Опыт	Контроль
1	Субстрат для АсАТ или АлСТ, мл	0,25	0,25
2	Физиологический раствор, мл	−	0,05
3	Сыворотка крови, мл	0,05	−
4	Инкубируют 60 мин при 37°С
5	2,4-Динитрофенилгидразин, мл	0,25	0,25
6	Перемешивают и оставляют на 20 мин при 20°С
7	Раствор NaOH , мл	2,5	2,5
8	Через 10 мин фотометрируют против Н2О (λ= 500 нм, толщина кюветы 0,5 см). D500
9	Dоп−Dк

Расчёты

Расчет активности производят в мккат/л по калибровочному графику (данные для его построения приведены в таблице).

Активность АлАТ или АсАТ, мккат/л	Dоп―Dк
0,1	0,025
0,2	0,05
0,3	0,08
0,4	0,11

Норма:АлАТ= 0,05-0,12 мккат/л; АсАТ= 0,06-0,14 мккат/л. Верхний предел―0,42 мккат/л.