Ход работы

Метод теплой трипсинизации используют для дисперги­рования тканей почек, полученных от поросят, телят, ягнят кроликов, собак, хомяков, а также почек взрослых животных и других тканей. Метод включает следующие этапы:

а) корковый слой почки срезают и измельчают на кусочки размером 2 — 5 мм, ткань многократно (3—4 раза) промывают физиологического раствора до полного освобождения от эритроцитов;

б) отмытые кусочки ткани переносят в пробирку и добавляют 0,25%-ный раствор трипсина, в которой перемешивают ткань 10 — 30 мин. После осаждения кусочков ткани надосадочную жидкость сливают, а к ткани добавляют, свежую порцию 0,25 %-ного раствора трипсина в соотношении 1:10-20. Температура раствора может варьировать от комнатной до 37С. Дезагрегацию ткани ферментом повторяют 2-3 раза;

в) последнюю экстракцию сливают в пенициллиновый флакон, клетки осаждают в течение 10-15мин;

г) осадок клеток собирают (с помощью пипетки) со дна флакона стараясь не захватывать крупные агрегаты ткани и определяют концентрацию клеток в суспензии.

Значительно реже для дезагрегации клеток используют ме­ханический способ.

Определение концентрации клеток. Для приготовления по­севной концентрации клеток необходимо вначале определить их концентрацию в исходной суспензии. Подсчет клеток про­изводят в счетных камерах различных систем (Горяева, Спенсе­ра, Бюркера, Тома, Фукс-Розенталя и др.). Для подсчета отби­рают пробу после тщательного перемешивания суспензии клеток. Для дифференциации живых и мертвых клеток исполь­зуют витальные красители: метиленовую синь или нейт­ральный красный. Подсчитывают количество живых клеток в 3 — 4 камерах (увеличение микроскопа: окуляр 7, объектив 20 по всей площади камеры, четырехкратно, каждый раз, заряжая камеру вновь, причем, во внимание берутся только те клетки, которые расположены в камере, в границах, очерченных сеткой – 225 больших квадратов), определяют среднее значение и рассчитывают концентрацию клеток в 1 мл по формуле, соответствующей дан­ной системе камеры, например для камеры Горяева:

где 100- количество кубических миллиметров в 1 cм; а - количество клеток в камере; н - разведение клеточной суспензия; 0,9 - объем камеры Горяева в мм³

Материалы, представляемые в отчет по лабораторной работе

1. Описать последовательность проведения работ

2. Результаты работы записать.

3. Изложить выводы по работе.

Литература по теме занятия

1. Павлович С.А. Основы вирусологии. – М.: «Высшая школа», 2001.

2. Практикум по общей вирусологии. – Под ред. И.Т. Атабекова. – М.: Изд-во МГУ, 2002.

3. Основы медицинской бактериологии, вирусологии и иммунологии. – Под ред. Г.М. Шуба. – М.: Логос, 2003.

4. Райкис Б.И. Общая микробиология с вирусологией и иммунологией (в графическом изображении). – М.: Триада-Х, 2002.

5. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. – Под ред. А.А. Воробьева, Ю.С. Кривошеина. – М.: «Высшая школа», 2001.

14