МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ рф

ВЯТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Получение почечной культуры клеток морской свинки методом теплой трипсинизации

Методические указания

к лабораторной работе

Дисциплина «Экология микроорганизмов»

Киров 2005

Составил:

доцент кафедры «биология»

кандидат биологических наук К.Е. Гаврилов

Порядок проведения занятия

1. Введение – 5 минут.

2. Письменный контроль исходного уровня знаний (решение тестовых заданий) – 15 минут.

3. Собеседование по вопросам самоподготовки и коррекция знаний – 45 минут.

4. Самостоятельная работа – 65 минут.

5. Подведение итогов занятия –3 минуты.

6. Сбор отчетов (альбомов) для проверки преподавателем – 2 минуты.

Техника безопасности

При выполнении лабораторных работ необходимо неукоснительно соблюдать общепринятые правила безопасного обращения с кислотами и щелочами, лабораторной стеклянной посудой (предметными и покровными стеклами, пипетками, чашками Петри, пробирками и др.), электрооборудованием (осветителями); соблюдать осторожность при использовании открытого огня (спиртовки); не допускать пролива и возгорания легковоспламеняющихся жидкостей (этилового спирта, эфира).

Цель занятия

• Получить почечную культуру клеток морской свинки методом теплой трипсинизации

Вопросы и задания для самоподготовки

1. Биогеохимические круговороты

2. Методы оценки геохимической деятельности микроорганизмов

3. Круговорот серы

4. Круговорот углерода

5. Парниковые газы

6. Экологические стратегии и биотические связи у микроорганизмов

7. Биотические связи с участием микроорганизмов

8. Симбиотические отношения между микроорганизмами.

9. Эволюционная роль симбиотических взаимоотношений с участием микроорганизмов

10. Значение коэволюции в симбиозах микроорганизмов с макроор­ганизмами

Оборудование и материалы

1. Микроскоп биологический МБР-3 или аналогичный

2. Спиртовка.

3. Термостат.

4. Колбы, пенициллиновые флаконы.

5. Физиологический раствор.

6. Материалы (предметные стекла для микропрепаратов; пробирки стеклянные, вместимостью 15 мл; пипетки, вместимостью 1,0 и 5,0 мл с делениями).

Общие сведения

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК В ВИРУСОЛОГИ

Значение культуры клеток и тканей в диагностических виру­сологических исследованиях. Внедрение метода культивирова­ния клеток и тканей в вирусологию и диагностику вирусных болезней позволило не только познать глубже сущность виру­сов, но и расшифровать этиологию ряда болезней, создать вы­сокоэффективные противовирусные вакцины (живые и убитые) для профилактики их. Открытие Дж. Эндерсом и сотрудника­ми способности вируса полиомиелита размножаться в культуре клеток (фибробласты эмбриона человека) послужило началом широкого применения этой системы в вирусологии, а открытие цитопатогенного действия вируса западного лошадиного энце­фаломиелита способствовало практическому использованию его в диагностике инфекции.

Метод культуры клеток заключается в том, что от убитого животного как можно быстрее после клинической смерти берут ткань или клетки и до наступления биологической смерти по­мещают их в соответствующие питательные среды и условия, обеспечивающие поддержание процессов жизнедеятельности. Наряду с множеством других преимуществ метод культуры тканей относительно дешев и поэтому может быть использо­ван массово.

Разработка метода дезагрегации тканей ферментативным путем, усовершенствование методов культивирования клеток и состава питательных сред создали основы для широкого при­менения культуры клеток в изучении общих и частных проблем вирусологии, и в частности разработки методов лабораторной диагностики вирусных болезней. Успехи техники культивирова­ния культуры клеток позволили наблюдать не только видимые изменения в инфицированных культурах, но и привели к от­крытию гемадсорбирующих вирусов.

В настоящее время число вирусов, выделяемых с помощью однослойных культур, резко уменьшилось по сравнению с ко­личеством вирусов, открытых сразу же после получения вируса полиомиелита. Оказалось, что некоторые вирусы трудно изо­лировать в однослойных культурах. В таких случаях требуются более изощренные лабораторные методы, максимально при­ближающие условия культивирования вируса к естественным, например использование культур органов. Однако одно­слойные культуры клеток не утратили своего значения.

Чрезвычайно важную роль во внедрении техники культуры ткани в широкую вирусологическую практику сыграло исполь­зование в питательных средах антибиотиков и антимикотических препаратов. Это позволило проводить исследования большого масштаба без чрезвычайно трудоемкой работы по предупреждению микробной контаминации культур. Другими важными усовершенствованиями техники тканевых культур явились употребление веществ, позволяющих диспергировать клетки и производить перевивку их взвесью, получение одно­слойных культур клеток и введение в практику синтетических культуралъных сред постоянного химического состава, сво­бодных от ингибиторов, действующих на вирус. Разработка и применение простых методов культивирования фрагментов органов и тканей для выделения и выращивания вирусов также внесли большой вклад в изучение этиологии и патогенеза ви­русных инфекций.

Культура тканей позволяет получить достаточно чистый вирус (с небольшим количеством чужеродных антигенов), что очень важно при изготовлении сывороток и антигенов для серо­логических реакций. С помощью серийных пассажей вирусов в культурах клеток удается получать аттенуированные (апатогенные) штаммы, пригодные для производства вакцин.

В настоящее время в практической вирусологии широко используются не только первично-трипсинизированные, но и перевиваемые, и диплоидные клетки.

Номенклатура культур тканей и клеток. В 1996 предложена унифицированная терминология для тканевых культур животных. Основные положения ее приводятся ниже.

Культура тканей (tissue culture; Gewebekultur) — сборное понятие, обозначающее систему, в которой клетки, ткани или органы сохраняют жизнеспособность или способность размно­жаться in vitro более 24 ч. В зависимости от вида биологиче­ского объекта различают: культуру клеток (cell culture; Zell-kultur) — термин, который обозначает рост клеток in vitro и включает в себя также рост единичных клеток (клетки в куль­туре не образуют ткань); культуру тканей или органов (tissue or organ culture; Gewebe oder organ Kultur) — термин, который обозначает поддержание роста тканей, зачатков органов или их частей in vitro при сохранении их дифференцировки, структуры и (или) функции.

Эксплантат (explant; Explantat) — вырезанный кусок ткани или органа, используемый для культуры in vitro.

Однослойная культура клеток, монослой (monolayer; einschichtiger Zellrasen) — клетки, растущие в один слой на опреде­ленной поверхности.

Суспензионная культура (suspension culture; Suspensionkultur) — тип культуры, при котором клетки размножаются во взвешенном состоянии в питательной среде.

Первичная культура (primary culture; Primarkultur) — культура для получения которой использованы клетки, ткани или органы, взятые непосредственно из организма. К этому поня­тию не относятся эксплантаты новообразований, возникшие вследствие введения культур клеток экспериментальному животному.

Клеточная линия (cell line; Zellinie) получается из печечной культуры после первого пассажа. Складывается из боль­шого количества клеточных линий, представленных в первичной культуре.

Стабильная (перевиваемая) клеточная линия (established line; Dauerzellinie) — клеточная линия, обладающая способ­ностью к неограниченному количеству пассажей. Стабильной клеточной линией считается такая, которая пассировалась не менее 70 раз с 3-дневными промежутками.

Клеточный штамм (coil strain; Zellstamm) выводится из первичной культуры или из клеточной линии путем селекции или клонирования клеток со специфическими свойствами (мар­керами). Эти маркеры должны сохраняться во время дальней­шего культивирования. При описании штамма необходимо ха­рактеризовать его свойства, например наличие определенного хромосомного набора, специфических антигенов, устойчивости к определенному вирусу.

Подштамм (substrain; Unterstamm) можно получить из штамма путем изоляции единичной клетки или группы клеток, обладающих свойствами, которыми не обладают остальные клетки штамма.

Клон (clone; Klon) - популяция клеток, полученная путем деления (митоза) одной клетки.

Клонированный штамм или линия (clone strain or line; geklonter Stamm oder geklonte Linie) — штамм или линия, выве­денные из одного клона.

Диплоидная клеточная линия (diploid cell line; diploide Zellinie) — линия клеток, 75 % которой имеют такой же кариотип, как и нормальные клетки того вида, из которого они выве­дены. Диплоидное число хромосом необязательно равнозначно диплоидному кариотипу, поскольку возможны случаи, когда клетка может терять один хромосомальный тип и приобретать другой. В этом случае изменяется кариотип клетки, но ди­плоидное число хромосом сохраняется. Такие клетки следовало бы называть «псевдодиплоидными». Описание диплоидной кле­точной линии должно включать фактическое число обследо­ванных клеток, процент диплоидных клеток и кариотип.

Гетероплоидная клеточная линия (heteroploid cell line; heteroploide Zellinie) — линия клеток, которая содержит менее 75% клеток с диплоидным набором хромосом. Это не озна­чает, что клетки имеют характер новообразования или обла­дают способностью к неограниченному росту in vitro. При опи­сании гетероплодной клеточной линии следует указать наряду с кариотипом процент клеток исходной линии (stem line).

Субкультура (subculture; Subkultur) - перенос клеток одной системы в другую, пассаж.

Пассаж (passage; Passage) - синоним субкультуры, т. е. перенос клеток из одной системы в другую. При употреблении этого термина необходимо отметить, что именно пассируется, так как вирусологи используют его для обозначения переноса выращиваемой жидкости, а не клеток.

Число пассажей (subculture number; Subkulturzahl) — число переносов выращиваемых клеток из одной системы в другую.

Интервал субкультивирования (subcultureinterwall; Subkulturintervall) — интервал между последующими пассажами. Этот термин не имеет ничего общего с определением «время генера­ции клеток».

Время генерации клеток (cell generation time; Zellgenera-tionszeit) — интервал между последующими делениями клеток. Лучше всего определять с помощью микрофотографии. Тер­мин этот не идентичен термину «время удвоения популяции».

Время удвоения популяции (population doubling time; Verdopplungszeit). Термин касается всей популяции и определяет время, за которое количество клеток возрастает, например с 110⁶ до 210⁶.

Абсолютная эффективность посева (relative plating efficiency) – процент единичных клеток, которые после внесения в систему для выращивания (посев) образуют колонии. Обязательно всегда сообщать общее число введенных клеток, тип посуды и условия (род питательной среды, температура, атмосфера, СО₂).

Относительная эффективность посева (relative plating effi­ciency; relative Aussaateffektivitat) — процент посеянных клеток, образующих колонии по отношению к контролю, в котором за 100% принимается абсолютная эффективность посева. Необхо­димо всегда сообщать общее число введенных клеток, условия выращивания и абсолютную эффективность посева в контроле.

Фибробласты (fibroblasts; Fibroblasten) — клетки веретено­образной образующие волокна. В культурах клеток невозможно морфологически отличить фибробласты от клеток многих других типов. В культурах орга­нов и тканей, в которых сохраняются связи между клетками, фибробласты можно идентифицировать морфологически.

Фибробластоподобные клетки (fibroblast-like cells; fibro-blastenahnliche Zellen) — клетки неизвестного происхождения ве­ретенообразной.

Эпителиальные клетки (epithelial cells; Epithelzellen) — тес­но лежащие рядом друг с другом клетки, которые образуют слой с очень маленьким количеством межклеточного вещества.

Изменение культуры (culture alteration; Kulturveranderung) — постоянное изменение собственных свойств, так измене­ния морфологические, хромосомальные, чувствительности к вирусу, потребностей питания, способности роста, малигнизации и т. д. Термин «трансформация» следует употреблять только тогда, когда изменения являются следствием введения в клетки нового генетического материала. В настоящее время термин «культура тканей» включает в себя в широком смысле все методы — от культивирования отдельных клеток до культи­вирования целых органов.

Культивирование первичных однослойных культур. Пер­вичные культуры клеток обычно выращивают в стеклянных со­судах, закрытых резиновыми пробками. При благоприятных условиях клетки прикрепляются к стеклу в течение нескольких часов. Они прикрепляются лучше к мягким сортам стекла, со­держащим больше ионов натрия, чем к твердым, типа пирекс. При физиологических значениях рН клетки заряжены отрица­тельно, и их связь с отрицательно заряженными центрами сте­кла может осуществляться с помощью двухвалентных катио­нов (главным образом Са⁺⁺). В процессе метаболизма клетки выделяют протоны, которые могут вытеснять двухвалентные катионы, в результате чего нарушается адгезия, т. е. способ­ность клеток культуры прикрепляться к твердому субстрату, например к стеклу. Возможно, ионы натрия являются своего рода антагонистами протонов и способствуют их удалению из центров связывания клеток со стеклом. Подобного рода меха­низм, по-видимому, действует и в случае прикрепления клеток к другим субстратам. По мере увеличения плотности клеточ­ной популяции адгезия клеток друг с другом возрастает, тогда как адгезия их с субстратом уменьшается.

Клетка прикрепляется к субстрату только ведущим и зад­ним краями. Между стеклом и прикрепленными к нему клетка­ми обнаружено расстояние примерно в 10 нм. Передний край фибробласта представляет чрезвычайно тонкую мембрану (ши­риной 5 — 10 мкм), которая совершает волнообразные движения от ведущего края назад со скоростью ⅓— ½ мкм/с. Благодаря волнообразным контактам клеточной мембраны с субстратом движение присуще, по-видимому, также эпителиальным (эпителиоидным) и другим клеткам в культуре. Такие клетки за 1 ч могут переместиться на 133 мкм.

Обычно вслед за эксплантацией нормальных клеток на­блюдается период покоя. В течение этого периода клетки при­крепляются к стеклу, распластываются на его поверхности, но еще не вступают в стадию деления. В это время происходит адаптация клеток к условиям существования и подготовка к де­лению. Затем начинается размножение клеток. Скорость раз­множения клеток в культуре зависит от ряда факторов: исходной ткани, возраста животного, качества и рН питательной среды, количества клеток, температуры культивирования, а также от степени повреждения клеток в момент выделения ткани.

Оказалось, что далеко не все клетки, используемые при посеве, способны прикрепляться к стеклу и расти в однослойной культуре. Только 0,2% клеток, изолированных из тканей новорожденных мышей, были способны к росту в культуре. С воз­растом их количество постепенно снижалось. В селезенке и костном мозге морских свинок количество клеток, способных образовывать колонии, составило 10^-5. С возрастом значитель­но замедлялось и уменьшалось выселение клеток из эксплантированной ткани.

Клетки тканей взрослых животных прикрепляются к сте­клу в меньшем количестве, чем клетки эмбриональных тканей. С возрастом животного способность клеток различных тканей к росту в культуре меняется неодинаково. Основываясь на низкой высеваемости клеток, Сато (1960) и Царофф (1961) высказали предположение, что рост культуры происходит за счет спе­циальной категории клеток, составляющих меньшинство кле­точной популяции исходной ткани.

Суспензия ткани, дезагрегированной механическим спосо­бом, содержит ничтожно малый процент клеток, способных к росту на стекле. Зависимость результатов выращивания нетрипсинизированных клеток от возраста животных, по-видимо­му, объясняется тем, что клетки эмбриональных тканей или молодых животных не имеют достаточно выраженного поверх­ностного слоя и могут легко прикрепляться к стеклу и устанав­ливать необходимый для их роста обмен с культуральной сре­дой. Клетки почки эмбриона коровы росли одинаково хорошо до и после трипсинизации. Ростовая способность нетрипсинизированных клеток почки кролика находилась в обратной зави­симости от возраста животных. Нетрипсинизированные клетки 3 — 7-дневных кроликов образовывали монослой на 1—2 дня позже трипсинизированных клеток при одинаковых условиях выращивания. Клетки 10 —21-дневных кроликов, не обрабо­танные трипсином, образовывали изолированные зоны роста, а клетки более взрослых животных росли только вокруг кле­точных конгломератов, тогда как трипсинизированные клетки формировали монослой. Это свидетельствует о стимулирую­щем влиянии трипсинизации на рост клеток.

Однослойные культуры могут быть получены только при посеве определенного количества клеток на единицу поверхно­сти сосуда. Недостаточное количество клеток, так же как чрез­мерный избыток их, тормозит рост культуры. Для клеток мно­гих тканей оптимальная посевная концентрация находится в пределах 2 - 5 -10⁵ в 1 мл.

При выращивании первично-эксплантированных клеток применяют различные синтетические и полусинтетические среды. Для этих целей вполне пригодными оказались также среды, изготовленные на основе ферментативных гидролизатов белковых веществ. Из таких сред наибольшее распространение в вирусологической практике получила среда с гидролизатом лактальбумина.

Солевой раствор Хэнкса (или Эрда) с 0,5 % гидролизате лактальбумина (ГЛА), дополненный 2-10% сыворотки (чаше всего телят), оказался пригодным для получения однослойных культур трипсинизированных клеток различных тканей жи­вотных.

Несмотря на общие принципы выращивания свежеизоли­рованных клеток, в приготовлении однослойных культур кле­ток различных тканей животных имеются некоторые особенно­сти. Разработаны приемы, позволяющие наиболее эффективно получать и выращивать клетки различных тканей животных в первичной культуре.

В процессе массового производства клеточных культур ча­сто возникает необходимость в кратковременном хранении сус­пензии клеток. Температура 0—6°С оказалась более благо­приятной для сохранения жизнеспособности клеток почек обезьян по сравнению с 22 —24 °С и позволяет получить полно­ценную культуру в течение четырех дней хранения. Такие же условия были подходящими для хранения суспензии клеток по­чек телят. Через 24 ч хранения при 4 °С жизнеспособными оста­вались 70% клеток, через 48 ч - 60, через 72 ч - 50%, тогда как при 22°С - 44, 30 и 12% клеток соответственно. Клетки после хранения в течение трех дней образовали полноценный монослой. Измельченная ткань почек куриных эмбрионов или трипсинизированные клетки оставались жизнеспособными в питательной среде при 4°С в течение 10 дней, а трипсинизи­рованные клетки тестикул телят и поросят, хранившиеся в ро­стовой среде при 4 —5°С, сохраняли жизнеспособность 7 дней. Обычно для поддержания жизнеспособности клеток ис­пользуют те же среды, в которых выращивают клетки, но без сыворотки. Иногда применяют специальную поддерживающую среду.

Питательны среды сбалансированные солевые растворы, используемые для культивирования клеток.

При кратковременном культивировании клеток основную роль играют такие факторы, как осмотическое давление, концентра­ция ионов водорода и других неорганических ионов, характер углевода и состав атмосферы. Растворы, в которых эти фак­торы сочетаются определенной комбинации, называются сбалансированными солевыми растворами. Все сбалансированные солевые растворы являются производными физиологического раствора, разработанного Рингером. В состав его входят три катиона: калии, кальций и натрий. Первым сбалансированным раствором, предназначенным для клеток млекопитающих, является раствор Тироде. В настоящее время широко приме­няют растворы Хенкса и Эрла. Раствор Эрла обладает свой­ствами сильного буфера благодаря высокой концентрации би­карбоната натрия. Раствор Хенкса составлен таким образом, что он уравновешивается воздухом, а не СО₂. Для орошения и промывания клеток используют фосфатный буферный рас­твор Дульбекко и Фогта. Этот раствор также приме­няют в качестве основы раствора трипсина.

Естественные среды. В качестве естественных питательных сред для культур клеток используют аллантоисную или амниотическую жидкость крупного рогатого скота с добавлением нормальной лошадиной сыворотки или эмбрионального эк­стракта, гомологичную сыворотку крови, куриную плазму и куриный эмбриональный экстракт. Наиболее распростра­ненный природный ингредиент питательных сред — гидролизат лактальбумина, получаемый при ферментативном гидролизе белка молока. Среду, предложенную Мельником для культиви­рования клеток почки обезьяны и состоящую из раствора Эрла, гидролизата лактальбумина и сыворотки, с успехом приме­няют для культивирования первичных культур многих тканей.

Для обогащения сред с частично определенным химиче­ским составом часто используют другой продукт переварива­ния белка — триптозо-фосфатный бульон.

Среды из химически определенных веществ с добавлением естественных компонентов. Наиболее широко используемой средой такого типа является среда Игла, в состав которой входят раствор Эрла, тринадцать аминокислот, семь витаминов и 5-10% сыворотки крупного рогатого скота для культур кле­ток или сыворотка другого происхождения.

Среда 199 широко и успешно применяется как поддержи­вающая среда, а при добавлении сыворотки - как ростовая среда. Эта чрезвычайно сложная среда содержит почти все аминокислоты, витамины, некоторые предшественники нуклеи­новых кислот, дополнительные факторы роста, источники липидов и раствор Эрла с добавлением азотнокислого железа. Позднее среду 199 модифицировали, и она получила название среда 858. Эта среда значительно эффективнее среды 199. Бла­годаря увеличенному количеству восстановителей (гидрохлори­стого 1-цистеина, аскорбиновой кислоты и глютатиона) ее окислительный потенциал приближен к физиологическому уровню.

Поддерживающие среды предназначены для сохранения клеточных культур в хорошем состоянии в течение нескольких дней, недель с тем, чтобы свойства клеток оставались неиз­менными. Рост клеток должен быть максимально снижен, одна­ко чувствительность к вирусам должна полностью сохраняться. Во многих случаях для этого достаточно снизить концентра­цию сыворотки в среде или исключить сыворотку полностью.