Практика № 3 Микроскопия (продолжение) Занятие № 3 Микроскопический метод исследования. Морфология микроорганизмов (продолжение)
А. Обсуждение темы:
1. Включения у бактерий.
2. Окраска волютиновых зерен по методу Нейссера.
3. Капсулы бактериальной клетки. Методы окраски. Демонстрация окрашенных микробов с капсулой.
4. Морфология грибов: плесневых, дрожжеподобных, дрожжей.
5. Морфология актиномицетов.
6. Классификация и морфология спирохет.
7. Особенности строения спирохет, видимых при ЭМ.
8. Устройство и назначение конденсора темного поля зрения.
Б. Практическая работа
1. Приготовить мазок из кислого молока с окраской по Нейссеру.
2. Приготовить мазок из дрожжей с окраской по Граму.
3. Демонстрация включений у молочно-кислых бактерий при окраске по Нейссеру и Лёффлеру.
4. Демонстрация бледных трепонем в тёмном поле зрения.
5. Демонстрация боррелий клещевого возвратного тифа при окраске по Романовскому-Гимзе.
Вопросы для самоподготовки
а) включения у бактерий;
б) капсула бактерий;
в) морфология патогенных для человека грибов (дрожжеподобные грибы);
г) морфология спирохет;
д) морфология микоплазм;
е) морфология риккетсий;
ж) морфология актиномицетов
Письменное задание:
а) Записать технику окраски волютиновых зерен по Нейссеру и Лёффлеру
б) Нарисовать в виде схемы капсулу бактериальной клетки
в) Зарисовать ультраструктуру спирохет
г) Зарисовать псевдомицелий дрожжеподобных грибов
Включения
Включения являются продуктами метаболизма про- и эукариотических микроорганизмов, которые располагаются в их цитоплазме и используются в качестве запасных питательных веществ. К ним относятся включения гликогена, крахмала, серы, полифосфата (волютина) и др.
У некоторых бактерий, например, дифтерийной палочки, включения волютина имеют дифференциально-диагностическое значение. Они обладают способностью к метахромазии (окрашиваются в иной цвет, чем цвет красителя). Коринебактерии дифтерии – Гр+ (часто окрашиваются неравномерно), прямые или слегка изогнутые тонкие палочки с булавовидными концами, утолщенными за счет зерен волютина – темно-синие на голубом фоне при окраске по Лёффлеру; сине-черные на светло-коричневом фоне при окраске по Нейссеру; (при окраске по Граму волютин не выявляется).
Лактобациллы — Гр+ палочки различной длины с закругленными концами, часто собирающиеся в короткие цепочки. Иногда подвижны (перитрихи). Спор не образуют. Некоторые штаммы имеют цитоплазматическую зернистость (волютиновые зерна).
Вследствие высокой концентрации метафосфатов и других соединений фосфора гранулы волютина обладают метахромазией. При окраске щелочным метиленовым синим, уксуснокислым метиловым фиолетовым они имеют по сравнению с цитоплазмой более интенсивный цвет.
Окраска щелочным метиленовым синим по Лёффлеру. На фиксированный мазок наливают щелочной метиленовый синий на 3 – 5 мин, промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют. При этом цитоплазма дифтерийных коринебактерий (или молочнокислых бактерий) окрашивается в голубой цвет, гранулы волютина – в темно-синий.
Окраска уксуснокислым метиловым фиолетовым. Фиксированный мазок обрабатывают в течение 5–10 мин уксусно-кислым метиловым фиолетовым (метиловый фиолетовый, генциановый и кристаллический фиолетовый – 0,25 г, 5%-й раствор уксусной кислоты – 100 мл). Мазок промывают водой и высушивают, этом случае цитоплазма дифтерийных коринебактерий окрашивается в светло-сиреневый цвет, гранулы волютина – в темно-лиловый.
Окраска по Нейссеру – сложный метод окраски. Окраска гранул волютина этим методом включает три этапа.
Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислым метиленовым синим 1 мин, сливают краситель и промывают мазок водой.
Наливают раствор Люголя на 20 – 30 с, после чего сливают раствор.
Окрашивают препарат везувином 1 – 3 мин, после чего промывают водой и высушивают.
После окраски по Нейссеру цитоплазма клеток, имеющая кислую реакцию, воспринимает щелочной краситель везувин и становится желтой, а зерна волютина окрашиваются в темно-синий или коричнево-черный цвет. В настоящее время используют несколько вариантов этой окраски.