Примеры хромофорных групп

Хромофор	λмакс, нм
--С≡С--	180
--С6Н5	270
--NО2	270
>С=О	280
--N=N--	370

Белки имеют три типа хромофорных групп: собственно пептидные группы, боковые группы аминокислотных остатков и простетические группы. Первые две поглощают в УФ области и не поглощают в видимой области. В ближнем ультрафиолетовом диапазоне спектра поглощением обладают только три аминокислоты: триптофан, тирозин, фенилаланин. Максимумы поглощения, специфические для каждой аминокислоты, лежат в области 260-280 нм.

Таблица 3

Спектральные свойства аминокислот при нейтральном рН

Аминокислоты	Коэффициент молярной экстинкции, моль-1·см-1·л	Максимум поглощения, нм
Триптофан	5,6·103	280
Тирозин	1,38·103	275
Фенилаланин	0,18·103	257

При включении аминокислот в структуру белка их спектры не очень изменяются. Поэтому оптическая плотность раствора белка равняется сумме оптических плотностей триптофана, тирозина и фенилаланина. Аминокислоты в свободном состоянии содержат свободные карбоксильные и аминогруппы, поэтому их спектры поглощения могут изменяться с изменением рН. Наибольшие изменения при изменении рН раствора претерпевает спектр поглощения тирозина. В щелочной среде тирозин переходит в ионизированную форму – тирозинат. Спектр поглощения тирозината смещается в длинноволновую область с максимумом поглощения 294 нм. Спектры поглощения триптофана изменяются при применение высоких концентраций H₂SO₄, что приводит к ионизации NH-группы триптофана. В результате спектр поглощения триптофана изменяет форму и смещается в длинноволновую область.

Методом спектрофотометрического анализа оценивают чистоту белковых препаратов и отсутствие в них нуклеиновых кислот. С этой целью определяют значения оптической плотности на длинах волн 260 и 280 нм. Соотношение D₂₈₀/D₂₆₀ является показателем чистоты белкового препарата, если D₂₈₀/D₂₆₀1,6-1,7 – это показатель высокой чистоты образца.

Нуклеиновые кислоты поглощают только в УФ области (180-220 и 240-280 нм). Их хромофорами являются, в основном, пуриновые и пиримидиновые основания. Основные полосы поглощения всех нуклеотидов, кроме цитидина, сосредоточены около 260 нм; у цитидина – при 270 нм. Коэффициенты молярной экстинкции хромофорных групп биополимеров зависят от природы растворителя, рН, длины волны. В таблице 4 приведены коэффициенты молярной экстинкции при 260 нм для четырех оснований.

Таблица 4

Коэффициенты поглощения пуриновых и пиримидиновых оснований

Основание	Коэффициент молярной экстинкции, моль-1·см-1·л
Аденин	13,4·103
Гуанин	7,2·103
Цитидин	5,55·103
Тимин	7,4·103

Спектр поглощения ДНК есть суммарный спектр поглощения мономерных нуклеотидов; их основная полоса поглощения расположена при 260 нм. Однако поглощение нативной ДНК заметно меньше, чем поглощение всех оснований входящих в ее состав. При переходе от нативной ДНК (полинуклеотида) к мононуклеотидам происходит прирост поглощения – гиперхромный эффект. Гиперхромизм проявляется уже в динуклеотидах (от 2 до 11%). Эффект возрастает с увеличением длины цепи и достигает максимального значения у олигонуклеотидов из 5-6 остатков.

Величину гиперхромного эффекта оценивают, измерив оптическую плотность при 260 нм для нативной ДНК (или полинуклеотида) – D₂ и денатурированной ДНК (или мононуклеотида) – D₁, по формуле:

(9)

Гиперхромизм проявляется при переходе от двухспиральных структур к односпиральным (однако в меньшей степени, чем при переходе от полинуклеотидов к мононуклеотидам). Он обусловлен тем, что в двойной спирали ДНК плоскости оснований параллельны (в виде стопок): такая конфигурация приводит к сильному взаимодействию оснований и снижению поглощения. Гиперхромный эффект широко используется как критерий денатурации ДНК.