Фенотипическое проявление первичных повреждений генетического материала

Кроме того, известны примеры формирования модификационных изменений при более или менее непосредственном влиянии на структуру генетического материала. С этой точки зрения фенотипическое проявление повреждений ДНК, устраняемых затем репарацией – тоже, по определению, модификационное изменение (как не наследуемое в ряду поколений, клеточных делений). Хорошо документированных примеров такого рода немного. Мне известны два.

Начало этой истории можно возвести к 30-м гг прошлого века, когда только формировалась теория мутационного процесса. Вспомним точку зрения Н.В.Тимофеева-Ресовского (К.Циммера и М.Дельбрюка), их теорию попадания, согласно которой мутация – внезапный переход молекулы гена из одного состояния в другое в результате попадания в него ионизирующей частицы или кванта энергии. Это – с одной стороны, а с другой – физиологическая гипотеза мутационного процесса М.Е.Лобашева, согласно которой акцент делался именно на процессе становления мутации через стадию (или стадии) репарации поврежденного генетического материала. Тогда впервые были поставлены рядом слова «мутация» и «репарация». С этой точки зрения важна была судьба т.н. первичных повреждений генов. М.Е.Лобашев и его ученики пытались вмешиваться в процесс превращения первичных повреждений в мутации, применяя дополнительные воздействия на мутагенизированный материал. Об этом несколько позже.

Впервые увидели последствия первичных повреждений по их фенотипическому проявлению Resnick M. & Holliday R., в 1971. Они показали на Ustilago maydis, что после его облучения УФ-светом (без фотореактивации) синтезируется больше CRM (Cross Reacting Material), т.е. инактивированного фермента нитрат редуктазы, чем после фотореактивации. Активная нитрат-редуктаза соответственно синтезировалась лучше после фотореактивации, чем без нее. Объяснение: первичные повреждения ДНК – фотопродукты экспрессируются до фотореактивации (или иного типа репарации). Увы, на этой модели затруднены масштабные количественные исследования и отсутствует дискретное фенотипическое проявление эффекта облучения.

От этих недостатков свободная другая модель – локус (идиоморф) MAT дрожжей Saccharomyces cerevisiae.. Необходимо напомнить жизненный цикл, систему типов спаривания и механизм их переключения у дрожжей. Вблизи центромеры 3 хромосомы находится локус MAT, который может быть представлен идиоморфом MAT_α или MAT_a. Кроме того, в левом и правом плечах той же хромосомы находится “запасная” генетическая информация – кассеты HML_α и HMR_а, соответственно для α и для a.

MAT_α состоит из двух участков (генов): MATα1 - позитивного регулятора α-специфичных генов (αsg) и MATa2 – негативного регулятора а-специфичных генов (asg). MATα1 и MATa2 транскрибируются в противоположные стороны с общего промотора. Инактивация каждого из них приводит к инактивации типа спаривания. Такие клетки не скрещиваются. Двойные мутанты matα1 matα2 имеют фенотип “рецессивный a”, или Alf- a like fakers. Это связано с тем, что гены asg экспрессируются конститутивно. К таким же последствиям (фенотип Alf) приводит делеция или повреждение центрального промотора между matα1 и matα2.

Другое дело MAT_a, его инактивация у гаплоида ничего не меняет, поскольку функции, необходимые для его спаривания конститутивны, и к изменению тип спаривания может приводить только транспозиция в локус MAT кассеты HML_α , находящейся в левом плече 3 хромосомы. Именно поэтому для эксперимента и выбрано “незаконное” скрещивание α X α. Действительно, гибридизация a X a и α X α дают принципиально разные результаты.

К “незаконной” гибридизации MAT_α X MAT_α могут приводить несколько событий: потеря 3-й хромосомы (?), потеря правого плеча 3-й хромосомы, реципрокная рекомбинация MAT и HMR , превращение MAT за счет конверсии из HMR , двойные мутации α1 α2 или одиночная мутация в двустороннем промоторе. См. картинку.Это все события приводящие к стабильным генотипическим изменениям. Часть из них летальна в гаплоиде. Имея соответствующие маркеры в 3 хромосоме, все классы событий легко идентифицировать.

Общая частота такой гибридизации – около 1X 10^-5. При этом возникает подозрительно много гибридов (доля) сохраняющих исходный тип спаривания Генотип гибридов (α) от скрещивания α X α можно проверить в генанализе, скрещивая их повторно, но теперь уже с гомозиготами по MAT_a. Тетрадный анализ полученных таким образом тетраплоидов выявил, что незаконные гибриды типа спаривания α в действительности гомозиготны по MAT_α.. Это, однако, для любителей тетрадного анализа у тетраплоидов – трудоемко. Можно проще. Как съесть пудинг и одновременно сохранить его?

Для этого используется незаконная цитодукция. При этом вы наблюдаете гибридизацию и одновременно клонируете ядро клетки-реципиента. Желательно отсечь события в клетке-доноре. (Два пути – обрабатывать мутагенами реципиет, повышая частоту незаконного скрещивания или использовать диплоидный донор) Тем самым можно идентифицировать, что же в реципиенте происходило до или в момент гибридизации. То, что находят в гибридизации и цитодукции: фенотипы и их объяснение. Действительно оказывается, что 80-90% незаконных цитодуктантов α X α сохраняют свой тип спаривания. Видимо, происходило временное не наследуемое изменение типа спаривания. Плюс совершенно неожиданный, казалось бы, класс цитодуктантов – nm, не способные спариваться. Они нам еще пригодятся. Что же это за события, которые приводят к незаконной гибридизации без изменения типа спаривания?

Для повышения разрешающей способности метода - два подхода. Облучение реципиента повышает частоту незаконной гибридизации, а частота цитодуктантов, сохранивших тип спаривания остается столь же высокой. Не имеем ли мы дело с фенотипическим проявлением первичных повреждений в ДНК идиоморфа MAT_α? К повышению частоты незаконной гибридизации с теми же последствиями приводит и введение в клетки реципиента мутаций rad18 и rad52, блокирующих пострепликативную репарацию.

А действительно ли события происходят в MAT_α? Действительно там, поскольку, если в качестве реципиента в цитодукции (или в незаконном скрещивании) взять анэуплоид с лишней хромосомой 3, гомозиготный по MAT_α,, то незаконная гибридизация резко подавлена (не происходит). Более того, достаточно в гаплоид-реципиент ввести дополнительную копию MAT_α, и незаконная гибридизация не происходит. Получается, что именно в MAT_α происходит некое модификационное изменение (в ДНК) в виде первичных повреждений, устраняемых затем (после гибридизации) репарацией, и эти изменения рецессивны (как всякая потеря функции).

Если мы имеем дело с первичными (предмутационными?) повреждениями, то где же реальные мутации? Они действительно возникают. Это – мутанты Alf. И более того, это – нейтральные, не способные к спариванию цитодуктанты, которые не могли возникнуть до спаривания. Они – результат последующей, после спаривания реализации первичных повреждений в виде мутаций. Реальные мутации составляют немногие проценты от всех событий приводящих к незаконной гибридизации.

Ничего подобного не происходит при незаконной цитодукции a X a. Подавляющее большинство цитодуктантов проявляют измененный тип спаривания. Чего и следовало ожидать. Рассмотренная система представляет собой т.н. α-тест для выявления генетической опасности факторов окружающей среды. Преимущества его в том, что выявляются не конечные результаты процесса (мутагенеза), а его промежуточный этап. Это открывает возможности для поисков антимутагенов.

Это пример того, что модификация может быть обусловлена механизмом, используемым для становления мутационного изменения. Т.е мутации и некоторые модификации могут иметь нечто общее. Временная инактивация регуляторных генов может приводить к врожденным (хотя и не наследуемым) аномалиям у многоклеточных, представлять собой пример т.н. шумов индивидуального развития.

А вот у одноклеточных, как мы видели такие модификации (назовем их обратимой, временной трансдетерминацией клеточного типа), хотя и не наследуются сами по себе, тем не менее, приводят к необратимым (наследственным) событиям – гибридизация с установлением диплоидного состояния. Пример хитросплетения наследуемых и не наследуемых событий.

Итак, изменение ДНК, но не мутации. Скорее – “недомутации”. По определению – модификации. Временные, случайные. Вспомните Астаурова с tetraptera. Актуальность этих игр иллюстрирует статья в Nature: J.Paulsson. Summing up the noise in gene networks. Nature. 2004. V. 427. P.415-418.

В 2004 г появилось сообщение, что в стареющем человечьем мозгу (после 40) целый ряд генов экспрессируется слабее. Эти гены играют важную роль в синаптической пластичности, транспорте везикул и функционировании митохондрий. Это сопровождается стрессовым ответом – индукцией генов антиоксидантного метаболизма и репарации. Повреждения ДНК достоверно повышены в промоторах с пониженной экспрессией в стареющем кортексе. Действительно в культуре в этих нейронах эти промоторы избирательно повреждаются оксидативным стрессом и обнаруживают сниженную эксцизионную репарацию. Т.о. повреждения ДНК могут избирательно снижать активность “ослабленных” генов, ответственных за обучение, память и выживание нейронов, тем самым, инициируя программу старения мозга.