Адаптивные модификации

Клеточный стресс, белки теплового шока, шапероны. Ritossa, 1962.

Реакция на тепловой шок – пример адаптивной модификации с регуляцией на транскрипционном уровне.

Реакция клетки (организма) на стрессирующие воздействия включает синтез ряда белков. Их набор перекрывается при разных стрессирующих воздействиях: на высокую и низкую температуры, окислительный стресс, этанольный и т. д. Лучше всего изучен тепловой шок. Существует система консервативных (семейств) белков теплового шока, синтезируемых в ответ на Т-шок у всех организмов: Hsp70, Hsp60, Hsp90. Все белки ТШ – шапероны, т. е. белки, которые cвязывают “свежие”, частично-денатурированные (unfolded) или несобранные (unassembled) белки, участвуя в их биогенезе: (1) блокируя ошибочные (nonproductive) взаимодействия и (2) стимулируя правильную сборку доменов (друг с другом) и олигомеров белков. Основные две группы молекулярных шаперонов: 70 кД (Hsp70) и 60 кД (шаперонины, или Cpn 60 ). Они “цепляют” частично денатурированные (unfolded) белки или готовые полипептиды по выходе из рибосом и заканчивают их укладку. Некоторые Hsp 70 локализованы на внутренней мембране митохондрий и на эндоплазматическом ретикулуме. Они обеспечивают транспорт белков через мембраны.

Наряду с Hsp 70, Hsp 60, исследованными лучше всего, известны и другие шапероны – Hsp 90, пролин-изомеразы, дисульфид-изомеразы, которые участвуют в складывании белков. Некоторые шапероны, например, Hsp 104, синтезируемые только при температурном шоке, видимо, делают примерно то же.

Hsp 70 (КАРТИНКА) очень консервативны от бактерий (DNAK E. coli) до человека имеют 50-90% идентичности по аминокислотам (по первичной структуре). Среди эукариот это семейство имеет 50-98% идентичности. У дрожжей их 8 штук. Связывает АТФ и пептиды, обладает слабой АТФазной активностью. Предполагается, что С-терминальный домен похож на антиген комплекса гистонесовместимости I класса. Предварительные данные ЯМР показывают, что DnaK связывает, по меньшей мере, один пептид, независимо от его структуры. Освобождение пептида сопровождается гидролизом АТФ, что указывает на взаимодействие между С-доменом (связывающим пептид) и N-доменом (АТФазным). Из 8 Hsp 70 S. cerevisiae один член этого семейства – митохондриальный (Ssc1p), более всего похож на бактериальный (E. coli), а не на какой-либо другой Hsp 70 эукариот. Симбиогенетика, однако. Инактивация Ssc1p блокирует импорт белков в митохондрии.

Ssc1p одновременно служит некаталитической субъединицей эндонуклеазы. Эндо Sce1 осуществляет двойные разрывы в строго-определенных местах ДНК, расщепляя мито-ДНК на несколько фрагментов in vitro. Похоже, она вовлечена в общую рекомбинацию мито-ДНК. Опять же модульный принцип. Вспомните такие примеры, когда речь зайдет о связи модификационной и наследственной изменчивости.

Hsp 70, локализованный в эндоплазматическом ретикулуме, он же Kar2p. KAR2 существен для жизнеспособности. Kar2 участвует в транслокации белков через мембраны и взаимодействует с Sec61. Мутанты kar2 имеют фенотип Hfc и взаимодействуя с sup35(45) часто дают летальный эффект (Тихомирова, не опубл).

Hsp 70 в цитоалазме – гены SSA, SSB Экспрессию трех из четырех генов SSA индуцирует Т-шок. Экспрессию SSB Т-шок подавляет. Гены SSA незаменимы. Если все их делетировать, клетка погибает. Сходство этих четырех генов SSA у дрожжей – от 80 до 97%. Белки Ssa имеют перекрывающиеся, но не идентичные обязанности в клетке. Все они вовлечены в транслокацию белков.

Два гена SSB идентичны на 99% по первичной структуре кодируемых ими белков. Дизрупция обоих генов (но не каждого в отдельности) приводит к замедлению роста при всех температурах и к холодо-чувствительности. До 73% SsBp связаны с рибосомами, точнее с синтезируемыми полипептидами, поскольку SsBp освобождается при действии пуромицина и аналогов аминоацил-тРНК. Двойные мутанты ssb1 ssb2 растут медленно (см. ранее). Этот эффект подавляет сверх-экспрессия генов TEF, кодирующих фактор элонгации EF1A. Кроме того ssb1 ssb2 обладают повышенной чувствительностью к ингибиторам трансляции: аминогликозидам и verucarin A. У них уменьшено количество активных рибосом. Т.о. Ssb действительно играют какую-то роль в трансляции. По мнению Нельсона (Nelson et al. 1992. Cell. Vol. 71. P. 97-105) Ssb цепляют полипептид в Exit-сайте рибосомы.

Белки, взаимодействующие с Hsp 70 (гомологи DnaJ). У кишечной палочки DnaK (Hsp70) взаимодействует с DnaJ (стимулирует гидролиз АТФ) и GrpE (способствует освобождению связанного нуклеотида). У дрожжей похоже 4 гомолога DnaJ.

Hsp 60. Шаперонины.

Митохондриальный Hsp 60 – гомолог системы GroEL-GroES бактерий – “горшочек с крышечкой”. Участвует в транспорте и созревании митохондриальных белков. АТФ-зависим.

Цитоплазматические Hsp 60 делают то же, что и митохондриальный, но в цитоплазме. Пока изучен один жизненно-важный ген из этой серии – TPC1. Мутанты по этому гену чувствительны к беномилу. Похоже, Tpc1p непосредственно связывается с тубулином, превращая этот белок в форму, образующую димеры и далее полимеризующуюся в микротрубочки. Hsp 70 и Hsp 60 вовлечены в единый путь транспорта, складывания и созревания белков.

Hsp 90 консервативны у бактерий и эукариот и преимущественно находятся в цитоплазме. У дрожжей –2 белка – Hsc 82. Один конститутивный, а другой с низким базальным урровнем, синтез которого повышается в 10-15 раз при температурном шоке. Дизрупция обоих генов безусловно летальна. Дизрупция каждого из них приводит к термочувствительному росту. Участвуют в складывании активной конформации белков. Взаимодействуют со стероидным рецептором, как условие связывания гормона, что в свою очередь необходимо для связывания с ДНК. Освобождение Hsp 90 из комплекса превращает его из не связывающего ДНК в связывающий ДНК. Drosophila и Arabidopsis истории С.Линдквист (1998, 2002), показывающие роль Hsp90 в нейтрализации малых мцутаций и аномалий белковых молекул – “фенотипический буфер”.

+ два класса консервативных белков – протеин дисульфид изомеразы и пептидил-пролил цис-транс изомеразы. Для того и другого класса белков у дрожжей по несколько генов.

Hsp 104 сильно индуцируется температурой. При нормальной температуре базальный уровень низок. Не существенен для жизнеспособности, но важен для термотолерантности. Дезагрегаза. Участвует в [PSI]-story, как транс-активный фактор, отвечающий за образование “семян”.

Система клеточных шаперонов работает взаимосвязанно с системой протеолиза. Инактивированные температурой белки могут быть: (1) восстановлены, например при действии DnaK и его гомологов Hsp 70 или (2) уничтожены по принципу “кто не работает, того едят” . Главный путь деградации – через убиквитинирование. Деградация белков индуцируется стрессорами, например температурой или аналогами аминокислот, например, канаванином (аналог аргинина). Убиквитин – консервативный белок в 76 аминокислот, активируемый специальным белком-активатором (гены UBA, 1 изолирован). Активированный убиквитин переносится на убиквитин-конъюгирующий фермент (гены UBC, их по меньшей мере 10), а отуда на белок-субстрат, который таким образом метится и далее переваривается в протеосоме. Система консервативна. В клетках млекопитающих – цилиндрическая структура 20S, состоящая, по меньшей мере, из 12 разных белков, уложенных четырьмя кольцами в стопку. Сам комплекс обладает протеазными активностями (тремя). Дополнительный белковый компонент привносит способность переваривать убиквитинированные белки при образовании комплекса 26S.

У дрожжей UBI4 – единственный термоиндуцируемый ген кодирует 5 тандемных повторов убиквитина, которые пост-трансляционно расщепляются до уби-мономеров. UBI1-UBI3 кодируют фьюжены уби- с некоторыми рибосомными белками. Делеция UBI4 не сказывается при росте в диапазоне температур от 23 до 36^о, при 16^о и при 38,5^о жизнеспособность клеток резко снижена – до 1-5% по сравнению с 60% (?) для дикого типа.

Гены убиквитин-конъюгирующих ферментов много что умеют: UBC2 = RAD6, UBC3=CDC34 вовлечены соответственно в репарацию ДНК и в переход G₁ – S в клеточном цикле. UBC1, UBC4, UBC5. UBC4, UBC5 конститутивны и индуцируются при высокой температуре.

HSE (Heat Shock Element) - транскрипционный элемент, необходимый для индукции (на уровне транскрипции) генов теплового шока. Это – 5 оснований: nGAAn в разных ориентациях . Для связывания белка Hsf (Heat shock factor) нужны как минимум два таких пентаплета. Пример HSE D. melanogaster из гена, кодирующего Hsp 83:

CaTCc aGAAg ccTCt aGAAg tTTCt aGAga cTTCc

Hsf образует тримеры, как в растворе, так и in vivo. Ген HSF дрожжей-сахаромицетов необходим для жизнеспособности. Межвидовые гомологии слабы, например между S. cerevisiae и Kluiveromyces lactis – 18% идентичности по первичной структуре белка, преимущественно в областях связывания с ДНК и в участках, ответственных за тримеризацию. Тем не менее, Hsf S. c. Можно заместить на Hsf K. l. Можно слить N- и C- фрагменты этих факторов и такие рекомбинантные белки работают. Т. о. Укладка и доменная организация у этих белков одинакова. ДНК-связывающий домен Hsf напоминает ДНК-узнающую спираль σ-фактора бактерий. Несмотря на малую аминокислотную гомологию (% идентичности), Hsf разных видов имеют одинаковое соотношение гидрофобных и заряженных остатков там, где взаимодействуют (тримеризуются) субъединицы. Т. о. Консервативна общая пространственная структура белка.

Активация Hsf осуществляется действием температуры. У дрозофилы, человека и шизосахаромицетов Hsf связывается с ДНК только после теплового шока. У сахаромицетов – и без теплового шока. Любые Hsf после шока активно фосфорилируются. Т.о. для активации транскрипции хитшоковых генв необходимо связывание (активируемое температурой) Hsf с ДНК и\или фосфорилирование. У млекопитающих Hsf можно активировать in vitro действием денатурирующих агентов. Дрозофилиный Hsf, сиртезированный в E. coli, но не в ксенопусе связывается с ДНК без всякого температурного воздействия или денатурационной активации. Отсюда следует предположение, что in vivo Hsf связан с каким-то негативным регулятором, от которого его “отрывает“ температура или денатурирующие агенты. Может быть это – белки Hsp, которые после температурного воздействия связываются с термо-поврежденными белками и диссоциируют из комплекса с Hsf. Последний освобождается из комплекса для активации генов HSP. Cвязывание с ДНК может регулироваться переходом мономер-тример у сахаромицетов и дрозофилы. Этот переход может также зависеть от контакта с белками Hsp, которые маскируют поверхности, необходимые для тримеризации или для фосфорилирования, в отсутствие температурного воздействия. Возможно, температура активирует Hsf непосредственно. Это гипотезы (1992).

У сахаромицетов Hsf не нуждается в высокой температуре для связывания с ДНК. Его транскрипционная активность регулируется негативно. Фрагменты Hsf – участок тримеризации и часть ДНК-связывающего домена нужны для репрессии, судя по данным делеционного анализа. Кроме того, важно фосфорилирование Hsf, степень которого коррелирует с транскрипционной активностью хит-шоковых генов. У человека Hsf1 сумоилирован (от SUMO – Small Ubiquitin-like Molecules). После стрессового воздействия Hfs1 и SUMO обнаруживаются вместе в ядерных стресс-гранулах. (Есть и такие).

Повышенная активность (30-100 раз) индуцированного Hsf временна – менее 1 часа. Тем не менее делеция HSF летальна и без повышения температуры. Он и гены HSP нужны и при росте в оптимальных условиях. Несколько примеров важности белков Hsp.

Умеренный температурный шок, приводящий к экспрессии HSP 70, продлевает жизнь дрозофилы. Дизрупция одного из шести генов HSP у мышей приводит к нарушению мейоза и апоптозу генеративных клеток, к стерильности самцов. У самок при этом нет проблем. У самок этот Hsp70-2 ассоциирован с СК. У дизруптантов редко дело доходит до мейоза, аномалии мейоза наблюдаются уже в поздней профазе.

Температурный шок способствует пост-ишемическому восстановлению. При некоторых аутоиммунных заболеваниях обнаруживаются антитела к Hsp 90 и убиквитину (системная красная волчанка), а также к Hsp70 и Hsp65 в случае ревматоидного артрита.

У человека известны заболевания, связанные с неправильным складыванием белков (табл.1 из Thomas, Bao-He Qu & Pedersen, 1995), которые в ряде случаев возникают в результате мутационных замен, препятствующих взаимодействию полипептида с шаперонами.

Позже

Сюда историю с цитоплазматическими стресс-гранулами и роли белка TIA-1 млекопитающих, полимеризующего SG’s по прионному механизму.