Лекция 2

Регуляция транскрипции у эукариот осуществляется преимущественно на стадии инициации. Транскрипционные элементы (нуклеотидные последовательности) и транскрипционные факторы (белки).

Тр. Элементы: UAS (Upstream Activating Sequence - пре-активаторы), URS (Upstream Repressing Sequence – пре-подавители), энхансеры (усилители), сайленсеры (глушители).

Транскрипционные активаторы содержат домен AD, или домен активации, который связывается с РНК-полимеразой (или σ) и домен BD, или домен связывания с ДНК. Последний узнает UAS. AD и BD связаны гибкой линкерной областью. Пример – Gal4 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Его BD можно заменить на аналогичный домен бактериального репрессора Lex A. Если в дрожжевую хромосому вставить 5’-регулируемую Lex A последовательность (бактериальную), слитую с каким-либо структурным геном-репортером, тогда такой химерный белок будет активировать соответствующий ген-репортер. Это отличная иллюстрация модульного принципа в организации регуляторных систем. AD консервативны в пределах надцарства. У эукариот они взаимодействуют с различными компонентами PIC, иногда через посредников – ко-активаторов. В активации может принимать участие энхансер. Белки, взаимодействующие с энхансером, изгибают ДНК, сближая его с UAS. Активации способствует ацетилирование и “разрыхление” гистонов.

Транскрипционные репрессоры. У бактерий репрессор связывается с ДНК, конкурентно по отношению к РНК-полимеразе (или белкам-активаторам) или препятствует движению РНК-полимеразы по ДНК. У эукариот механизм стерической интерференции (помех) встречается редко. У них репрессоры связываются с URS. Одни и те же белки могут выступать ко-активаторами для одних генов и ко-репрессорами для других. (Еще раз модульный принцип!). Примером могут служить белки Ada2 и Ada3 у дрожжей S. cerevisiae. Они могут стимулировать или подавлять транскрипцию некоторых генов, стимулируя или ингибируя некоторые белки-активаторы транскрипции. Репрессия может достигаться и деацетилированием гистонов при помощи гистондеацетилазы, которую привлекают к гистонам транскрипционные факторы.

Опероны и регулоны.

Хороший пример: SOS-репарация. Вспомните – активированный (не-репарированными повреждениями ДНК) белок RecA действует на белок LexA, индуцируя его самопереваривание (между Ala84 и Gly85). Тем самым репрессор оказывается инактивированным и индуцируются около 20 оперонов SOS-регулона и в том числе UMUD,UMUC, участвующих вместе с RECA в репликации в обход повреждений. Т.о. SOS-репарация = репарация, склонная к ошибкам. Мутагенез!.. Связь адаптивной модификации и мутацтонного процесса.

У эукариот нет оперонов, не верьте, что они есть у C.elegans (по крайней мере, что есть классические опероны, как у E. coli). Эукариотические рибосомы не умеют реинициировать трансляцию после нонсенса. И C.elegans – не исключение (или своего рода исключение в смысле “оперонной” организации). У этого червя – гены собраны в кластеры, с которых транскрибируется единая пре-мРНК, но затем она разрезается на куски, соответствующие отделным генам.

Полиаденилирование и де-полиаденилирование как механизмы регуляции через определение времени жизни мРНК. В этом процессе принимает участие Hsp70, связываясь с …AUUUA…- мотив, который повторяется несколько раз в 3’-UTR вблизи сайта полиаденилирования.

Дифференциальный, или альтернативный сплайсинг, особенно часто используется в образовании белков сигнальной трансдукции и прочих регуляторов в широком смысле.

Альтернативный сплайсинг находится под контролем негативной и позитивной регуляции, т.е. вырезание интрона может быть подавлено или стимулировано. Пример – альтернативный сплайсинг мРНК гена ras человека. Пре-мРНК (c-H-ras) может быть процессирована в две разные мРНК, благодаря сохранению или исключению т.н. альтернативного экзона IDX: для белков p21H-Ras и p19H-RasIDX, которые различаются только своим c-терминальным доменом. Последовательность после интрона – его сайленсер (rasISS1) действует вместе c IDX . Это - цис-активный элемент для негативной регуляции сплайсинга предшествующего интрона (т.е.IDX). Он связывает hnRNP A1. Наличие или отсутствие этого RNP in vitro (в ядерных экстрактах) коррелирует с подавлением или стимуляцией эксцизии IDX. Ингибирование сплайсинга снимает добавка двух белков: SC35 и SRp40. Эффект показан in vivo и in vitro. Кроме того в этом процессе участвует РНК-зависимая хеликаза p68. Если ее подавить, используя технику антисмысловой РНК (RNAi), то частота включения IDX в мРНК возрастает. Сделано на клетках HeLa (S.Guil et al., 2003).

Дифференциальный сплайсинг претерпевают про-мРНК около 35% генов млекопитающих. У человека – 60%.

Пример возможного молекулярного механизма экспрессивности и пенетрантности в связи с альтернативным сплайсингом. Альтернативный сплайсинг известен у мышей в гене Axin^Fu (с ретротранспозоном Intracisternal-A particle в интроне 6). Он происходит также у дикого типа, но в меньшей степени. Наблюдается корреляция между частотой аномалий развития хвоста и соотношением нормального и альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Чем чаще альтернативный сплайсинг, -тем сильнее проявляется мутантный фенотип (W.D.Flood, A.Ruvinsky. 2001. Heredity. V. 87. P. 146-152). Транскрипты около “… можно ожидать, что появятся мыши, не имеющие мутантного аллеля, и тем не менее проявляющие ненаследуемые аномалии хвоста, похожие на классический фенотип “fused”. Вариации генотипического фона и факторов среды могут влиять на частоту и степень проявления нарушений развития хвоста у мышей Axin^Fu. Этот ген кодирует белок-компонент сигнального пути, ответственного за формирование эмбриональных осей симметрии млекопитающих.

[Транс-сплайсинг.]

[Белковый “сплайсинг”.]

Регуляция на уровне трансляции.

Общая схема трансляции у бактерий.

[Белковый сплайсинг, которого пока нет]

Ауторегуляция оперонов рибосомных белков у бактерий (на уровне транскрипции и на уровне трансляции). Синтез рибосомных белков кодируют опероны, которые состоят только из структурных генов этих белков или включают также гены факторов трансляции, гены для субъединиц РНК-полимеразы, а также гены, контролирующие метаболизм РНК. Специфической чертой этих оперонов является аутогенная регуляция их транскрипции и трансляции. Обычно один из рибосомных белков, кодируемых опероном играет роль трансляционного репрессора (см.табл.), связывающегося с мРНК вблизи участка инициации транскрипции. Эти белки входят в число тех, что связываются непосредственно с рРНК в начале синтеза рибосом. В ряде случаев наблюдается явное сходство участков связывания этих белков в рРНК и в мРНК оперонв (см. рис.).

М.Номура и др. изменяя мутационным путем почти каждый нуклеотид в этих гомологичных структурах, показали, что они важны, как для регуляции соответствующего оперона, так и для сборки субчастицы 50S рибосомы.

Наряду с ауторегуляцией на уровне трансляции рибосомные белки могут осуществлять также и репрессию собственного синтеза на уровне транскрипции. Примером является белок L4, кодируемый третьим геном оперона S10, включающего 11 генов рибосомных белков. L4 участвует в аттенюации оперона - (NuSA-зависимой)- терминации транскрипции, происходящей приблизительно через 140 оснований после старта транскрипции и более, чем за 30 оснований до первого гена, как показали Дж.Зенгел и Л.Линдаль.

Мутанты с конститутивной, как транскрипцией, так и трансляцией получены по белку L4. Каждая из функций может быть изменена независимо от другой: трансляционная дерепрессия не сопровождается дерепрессией транскрипционной и наоборот.

Бактериофаг MS2.

Регуляция инициации, приводящая к дифференциальной трансляции разных генов показана для РНК-содержащего бактериофага MS2. Белковый фактор i (interference factor), связываясь с фактором инициации IF-3, меняет его сродство к различным участкам инициации. Фактор i эффективно ингибирует инициацию в гене белка оболочки РНК-содержащих фагов, не препятствуя при этом инициации в генах РНК-репликазы и белкаА.

Ещё более эффективным (по сравнению с фактором i) ингибитором синтеза белка оболочки бактериофага MS2 является сама РНК-полимераза, в состав которой фактор i входит в качестве одной из четырех субъединиц (рис.). Две другие субъединицы РНК-полимеразы представляют собой факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts.

Три перечисленных белка, входящие в состав РНК-полимеразы, кодируют гены E.coli, и только одну субъединицу кодирует ген РНК-репликазы бактериофага. РНК-полимераза подавляет синтез белка оболочки, присоединяясь к области инициации соответствующего гена.

Система GCN4 у дрожжей (регуляция на трансляционном уровне).

Регуляция самого этапа трансляции в экспрессии генов, контролирующих метаболические процессы, встречается редко. Наиболее подробно охарактеризована работами А.Хиннебуша и др. система регуляции аминокислотного метаболизма у дрожжей Sacch.cerevisiae, находящаяся под контролем гена GCN4.

При аминокислотном голодании усиливается экспрессия позитивного регулятора - GCN4 и контролируемых им нескольких десятков генов, имеющих последовательность: TGACTC, повторяющуюся в 5`-не транслируемой области. В лидерном участке самого GCN4 есть 4 коротких (3-4 кодона) открытые рамки считывания (см.рис.), начинающиеся кодоном-инициатором и кончающиеся терминатором. Как мы отмечали на с. , присутствие таких uORF (upstream Open Reading Frame) в мРНК эукариот подавляет инициацию на кодирующей последовательности, поскольку эукариотические рибосомы не склонны к реинициации.

Делеция всех четырех uORF или мутационная инактивация их инициаторов приводит к высокому уровню нерегулируемой экспрессии GCN4. Если же перенести эти 4 uORF в лидер другого транскрипта, то соответствующий ген экспрессируется и регулируется, как GCN4. Для эффективной работы лидера GCN4 существенная, как последовательность 4-х uORF, так и их размер, а также нуклеотидное окружение. Участки uORF гена GCN4 сами находятся под позитивным контролем генов GCN2 и GCN3, а также под негативным контролем генов серии GCD и по меньшей мере двух генов SUT2 и SUT3, кодирующих  и  субъединицы фактора инициации трансляции - eIF-2 (см.рис.).