Значение метилирования и не только…

При нарушении импринтинга в канцерогенезе Feinberg, 1983 наблюдал изменение характера метилирования ДНК: общее недометилирование отдельных генов, но в то же время гиперметилирование скоплений CpG в промоторах.

У Ascobolus наблюдается активное метилирование в процессе премейотического синтеза ДНК.

У аллотетраплоида Arabidopsis thaliana X Cardominopsis arenosa “замолчали” 10 генов того или другого родителя (локализованные в 4-х из 5-и хромосом Arabidopsis) среди них – 4 транскрипционных фактора, например TCP3. “Молчащие гены вблизи TCP3 гиперметилированы и активируются при блокировании метилирования ДНК”. Т.о. эпигенетические механизмы вовлечены в экспрессию ортологов в полиплоидных геномах. (Hyen-Se Lee & Z.J.Chen, 2001). Это явление сродни известному как косупрессия генов, когда у растений их оказывается больше нормы. R.Jorgensen, пытаясь получить более интенсивно-окрашенные цветки петунии, ввел в это растение дополнительные копии гена, ответственного за пигментацию. Вместо этого он получил пестрые цветки, а иногда и вовсе не окрашенные.

У Neurospora crassa известно явление мейотического глушения неспаренной ДНК своих гомологов, включая гены, представленные двуцепочечными молекулами. Известна мутация Sad-1, препятствующая этому эффекту. Ген SAD-1 дикого типа кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу (P.K.T.Shiu, N.B.Baju, D.Zickler & R.L.Metzenberg, 2001). Она умеет делать двуцепочечную РНК из мРНК?

Лекция 5 рнк (rnAi) в геномном импринтинге и регуляции экспрессии генов.

C.Mello and A,Fire

Нобелевские лауреаты 2006 г по физиологии и медицине

“за открытие интерференции РНК – глушение (silencing) генов при помощи двуцепочечной РНК”

РИС.1.

В 1998 г Файр (Стэнфордский университет) и Мелло (массачусетский университет) опубликовали в Nature статью, в которой показали, что появление в клетках червя C.elegans антисмысловой РНК приводит к подавлению функции гена, чьей мРНК эта антисмысловая РНК комплементарна. При этом происходит образование двуцепочечной РНК, сопровождаемое разрушением мРНК. Явление получило название интерференции РНК.

РИС.2.

Еще более сильный эффект (в 10 раз) вызывала инъекция в C.elegans непосредственно двуцепочечной РНК. При этом двуцепочечная РНК размножается, образуется много копий, они распространяются между клетками, даже могут наследоваться (судя по эффекту подавления экспрессии исследуемого гена) в следующем поколении. Тогда же авторы предположили, что такой механизм может лежать в основе регуляции ряда генов, что вскоре и подтвердилось. RNA_i, как назвали эту РНК оказалась вовлечена в контроль транспозонов (мигрирующих генов) и как предполагают защищает организм от вирусной инфекции, по крайней мере у некоторых низкоорганизованных объектов.

Вскоре RNA_i стали использовать для анализа неизвестных функций генов из секвенированных геномов. В перспективе такой же подход можно будет использовать для терапевтических целей.

Это – еще один прорыв в области эпигенетики. С другой стороны, это – дальнейшее развитие обширной области, которая стала весьма популярной в последние годы. Речь идет о регуляторных РНК. Это своеобразная реминисценция о том времени, когда жизнь была представлена исключительно молекулами РНК – 4(мир пре-РНК)-3,8(мир РНК) миллиардов лет назад. Первые ДНК-белковые представители жизни появились около 3,6 млрд лет назад. Напоминанием об этом древнем периоде остались рибозимы – молекулы биологических катализаторов, “сделанные” из рибонуклеотидов, а не из аминокислот. Рибозимы умеют не только самосплайсировать (вырезать) некоторые интроны (гр.I и II), но и проводить некоторые превращения низкомолекулярных соединений. Кроме того, вспомним функции рРНК, ее пептидилтрансферазную активность, центры связывания факторов трансляции, центр декодирования и т.д.

РИС.3.

Еще одно напоминание об этом далеком эволюционном прошлом – участие РНК в регуляции генной активности. Речь идет об интерференции РНК, или пост-транскрипционном “сайленсинге” (глушении, подавлении экспрессии) генов, кодирующих белки. Вот это явление и было обнаружено у нематоды Caenorhabditis elegans в 1998 г (Fire et al), как реакция на введение двуцепочечной РНК, приводившее к специфическому выключению гена, соответственно выбранной последовательности. При этом сначала использовали для инактивации генов антисмысловую РНК, а затем выяснилось, что двуцепочечная РНК гораздо (в 10 раз) эффективнее, чем смесь комплементарных цепочек. Введение нескольких молекул dsRNA в родительского червя блокировало экспрессию гена (белок мускулатуры ……) во всем животном и сохранялось в F₁ (!).

Интересны были в этом плане наблюдения, что у высших растений существует механизм, обеспечивающий устойчивость к РНК-овым вирусам, “отправляющий” двуцепочечную вирусную РНК “на разгрызание”. В обоих случаях в деле главной оказалась двуцепочечная РНК.

Этот механизм объясняет и глушение, или «сайленсинг» генов (оно же – косупрессия), который наблюдается также у нейроспоры, дрозофилы, С. elegans, а также у млекопитающих. Как множественная интеграция дополнительных генных копий или, даже одного гена может запустить образование дцРНК остается неясным. Гипотеза: эндогенные РНК-зависимые РНК-полимеразы могут различать аберрантные транскрипты, получаемые с активно-экспрессируемых генов, и превращают их в дцРНК. Такие РНК-полимеразы и вправду обнаружены у нематоды, нейроспоры, высших растений. Похоже, механизм глушения дцРНКами распространен среди очень многих, если не всех эукариот. Видно старый он эволюционно.

Работает этот механизм на разных уровнях. У червя и у растений события разыгрываются на пост-транскрипционном уровне. Использование последовательностей промоторов и интронов было неэффективным в таком глушении. У растений вдобавок происходит гиперметилирование последовательностей, гомологичных “of the silencing trigger”.

У дрозофилы, нематоды и грибов, похоже, затронутым при сайленсинге оказывается и структура хроматина. Наконец, (у C. Elegans) события разыгрываются и на уровне синтеза белка.

РИС.5/6.

В клетках дрозофилы нашли эндонуклеазу, известную теперь, как RISC-эндонуклеазу (RNA-induced silencing complex). Она синтезируется в ответ на обработку культуры клеток дрозофилы (S2) дцРНК.

Hamilton & Baulcombe нашли в растениях антисмысловую РНК размером около 25 нуклеотидов, гомологичную генам, испытывавшим косупрессию. Такая РНК образуется из дцРНК и в эмбрионах дрозофилы. Такая РНК изолируется совместно с активностью RISC-эндонуклеазы.Согласно модели сайленсинг начинается с того, что механизм, узнающий дцРНК, режет ее на куски 21-25 нуклеотидов. Эти маленькие интрферирующие РНК (small interfearing RNAs-siRNAs) – своего рода метка (signature) пути сайленсинга. Связывая RISC, они направляют комплекс к гомологичным последовательностям мРНК. Представители еще одного семейства нуклеаз - РНКазы III имеют домен для связывания дцРНК и каталитический домен. Эти консервативные нуклеазы нашли во многих объектах – их назвали Dicer-enzymes. Они превращают дцРНК в siRNAs, которая и связывается с RISC. Далее, комплекс узнает по гомологии мРНК и эндонуклеолитически разрушает ее.

РИС.7.

Ситуация различна у дрозофилы и человека с одной стороны и C.elegans и растений - с другой. У последних происходит размножение дцРНК благодаря активности РНК-завсимой РНК-полимеразы (RdRp), благодаря чему и становится возможным системное глушение экспрессии гена (которому гомологична эта siRNA), а возможно и наследование в следующем поколении.

Переход зимогена RISC в активный энзим сопровождается (коррелирует с ) расплетением siRNA. Hannon G. et al выделили RISC как рибонуклеопротеин ок. 500КDa из культуры клеток S2 D. melanogaster. RISC там со-очищается с AGO2 – членом семейства белков Аргонавт (Argonaut). (Был открыт у морфологического мутанта- по форме листьев у арабидопсис). Кодирующие их гены представлены, видимо, во всех организмах, кроме Saccharomyces cerevisiae (!?). Эти белки имеют по два участка гомологии- домены: PAZ и Piwi. Последний уникален для этой группы. PAZ есть и в Dicer и он может быть существен для сборки комплекса глушителя (silencing complex).

У C.elegans >20 генов родственных аргонавту, в том числе RDE-1 и RDE-4, которые нужны для инициации глушения в родительском организме, но не в F₁. А гены MUT-7 и RDF-2 как раз наоборот нужны для эффекта в F_1, но не у родителей. Видимо первичное глушение (у родителей) – узнавание экзогенной дцРНК отличается от узнавания вторичных дцРНК, продуцируемых РНК зависимой РНК полимеразой.

Rde-4 – небольшой белок, связывающий дцРНК, и кроме того, Rde-1 и Rde-4 взаимодействуют с Dicer C.elegans. Может быть Rde-4 сначала узнает дцРНК и доставляет ее к Dicer’у. Это согласуется с тем, что у червей (C.e.), лишенных Rde-4 , снижено количество siRNA, но зато ее (siRNA) много у червей без Rde-1. Простая схема, правда, пока не получается.

Существенно, что (1) глушение, запущенное небольшим количеством дцРНК, распространяется по всему растению (системное подавление экспрессии) и, даже распространяется на “неопытный” привой. Кроме того, (2) глушение распространяется вдоль гена: если взять 3’- фрагмент мРНК, то глушится не только он, но и все, что “до”. Т. о. глушение распространяется в обоих направлениях: 3’-5’ и 5’-3’, что не согласуется с активностью РНК зависимой РНК полимеразы. Тем не менее у растений и нематоды глушение, вызываемое дцРНК , требует наличия (зависит от) ферментов, схожих по последовательности с помидорной РНК зависимой (направляемой) РНК полимеразой - RdRP , которая использует антисмысловую цепь РНК в качестве затравки (праймера) для синтеза дцРНК. Это и обеспечивает системное глушение у растений (и червей). Такая амплификация не происходит у позвоночных и дрозофилы, поскольку гены для RdRP у них не обнаружены.

Возможно, все инициируется воздействием дцРНК на хроматин, изменение структуры последнего, приводящее к синтезу аберрантной мРНК, которая и служит субстратом для превращения в дцРНК при помощи RdRP.

Все эти соображения могут сгодиться для объяснения внутриклеточных механизмов глушения. Они не объясняют “системной” реакции у растений и животных.

Так, известно, что экспрессия Hc-Pro в “глушеных” корешках снимает глушение и подавляет продукцию siRNA, но системное глушение может распространяться из этих корешков в привитые побеги, лишенные этой активности (Hc-Pro). Недавно у нематоды идентифицировали белок, нужный для системного глушения. Это трансмембранный белок, возможно проводящий системный сигнал.

РИС.8.

Глушение может происходить не только путем деградации мРНК, но и за счет взаимодействия miRNA с мРНК, приводящего к подавлению трансляции.

РИС.9.

Предшественниеками интерферирующих РНК могут быть искусственные или естественные дцРНК, образующиеся путем взаимодействия разных (самостоятельных) молекул или двуцепочечные шпильки РНК, кодируемые геномом.

РИС.10.

Как мы упоминали этот механизм (RNA_i) может быть вовлечен в метилирование ДНК и модификацию гистонов и тем самым связан с геномным импринтингом.

Это показано для мыши. Участок в 400 kb (гены: Igf2r Slc22a2 Slc22a3) экспрессируется по материнскому типу. Для репрессии по отцовскому типу этих же генов требуется участок 3,7 kb, содержащий экспрессируемый по отцовскому типу ген Air, с которого читается не кодирующая РНК. Ее синтез коррелирует с репрессией всех трех генов на отцовской хромосоме. Air РНК перекрывается как антисмысловая с одним из этих генов. Синтез Air РНК нужен для сайленсинга. Если сделать делецию 96% этого гена (этой РНК), то экспрессия Air сохраняется импринтированной по отцовскому типу сохраняется и метилирование промотора (по отцовскому типу), но полностью исчезает репрессия генов Igf2r Slc22a2 Slc22a3 на отцовской хромосоме. Т.о. некодирующая РНК играет активную роль также и в геномном импринтинге.]

РИС.11.

Рассматривали несколько вариантов интерферирующих РНК, из которых к настоящему времени сохранились формально различаемые два класса – miRNA и siRNA. Их различия представлены на таблице. Думаю, что в ближайшее время останется всего один класс. Как только лучше поймем весь механизм.- РИС.12.

ОБЩЕЕ:

Одноцепочечные молекулы (21-22 нуклеотида) их нарезают из двуцепочечных предшественников белки семейства Dicer.

Программируют (контролируют) активность белков семейства Argonaute, входящих в комплекс RISC (RNA-induced silencing complex).

Нужны для глушения (silencing) экспрессии генов.

РАЗЛИЧИЯ:

siRNA Контроль развития. Делается из любой 2-цепочечной РНК. Размножаются посредством повторного разрезания и репликации. Действуют на комплементарные РНК, разрушая их. Модифицируют повторы ДНК и упаковывающие их белки. Последовательность широко варьирует. Всегда точно комплементарны мишени.

miRNA Подавление: вирусов, инсерции чужих генов, мобильных элементов. Метилирование ДНК, гистонов. Копии генов, не кодирующих белок. Взаимодействуют в цитоплазме (при помощи RISC) с мРНК и разрушают ее или блокируют ее трансляцию. Последовательность консервативна в царствах: растений, животных. Не полная комплементарность мишени. Метилирование нескольких сот пар нуклеотидов ДНК через ~ 10 000 пар н-тидов после места связывания miRNA. Мутации по сайту связывания подавляют метилирование, но miRNA взаимодействует не с ДНК, а с мРНК (пока она еще “рядом” с ДНК), возвращаясь из цитоплазмы в ядро.

Метилирование гистонов у Schizosacch. Pombe и у растений с участием siРНК.

Обнаружение этого механизма (не до конца еще изученного) открывает перспективы для функциональной геномики – исследование всего генома через двуцепочечные фрагменты, направляемые к желаемым генам. Это уже сделано для нематоды и делается для человека. Стало возможным выявление фенов для тех генов, которые открыты секвенированием, а мутаций по ним не получено. Теперь можно посмотреть на фенотип, возникающий при инактивации генного продукта (не важно как – деградацией мРНК или подавлением трансляции мРНК). Это – новый подход в т.н. «обратной генетике».

Наконец, возникли новые перспективы для лечения (?) наследственных заболеваний путем интерференции РНК тех генов, экспрессия которых нежелательна, например PRNP.

Сюда про (отсутствие) антисмысловую РНК у сахаромицетов.