Часть II. Искусственные генетические системы Глава 7.Принципы генной инженерии

Само название раздела молекулярной генетики, именуемого генной инженерией, указывает на то, что в результате такого рода исследований создаются искусственные генетические конструкции, в которых отдельные части генов или гены целиком объединяются в требуемой последовательности руками экспериментатора – генного инженера. Это позволяет определять их взаимное влияние и функциональное значение, а также проводить экспрессию генов в новом генетическом окружении. Таким образом, в экспериментальных условиях имеет место обмен генетической информацией как между отдельными генами организмов одного и того же вида, так и между организмами разных таксономических групп, что не происходит в природе из-за непреодолимых барьеров репродуктивной изоляции. Тем не менее, практически во всех методах современной генной инженерии фрагментарно (в адаптированном виде) используются элементы природных молекулярно-генетических механизмов.

Обмен генетической информацией между носителями этой информации – живыми организмами, а также составляющими их соматическими и половыми клетками является фундаментальным принципом существования всего живого. Половой процесс освобождает организмы от груза необратимых изменений в виде соматических мутаций и других многочисленных модификаций макромолекул, которые нарушают его нормальное функционирование в старости. Кроме того, в результате такого процесса геном нового организма воссоздается в новом сочетании аллелей, что, как правило, сопровождается расширением его адаптивных возможностей. Этот широко распространенный способ обмена генами между организмами с их передачей по вертикали, т.е. от поколения к поколению, не исчерпывает всего феномена обмена генами, непрерывно происходящего в биосфере.

Известна обширная группа генетических явлений, связанная с горизонтальной передачей генов в пределах одного поколения организмов, а также между клетками одного и того же многоклеточного организма. Характерными примерами такого рода являются специфическая и неспецифическая трансдукции, осуществляемые бактериофагами, в результате чего происходит перенос небольших частей генома микроорганизмов. Большое значение в эволюции бактерий играет и обмен генами с помощью конъюгативных плазмид и транспозонов, в частности распространение генов устойчивости к различным химическим веществам как в популяциях родственных бактерий, так и между представителями таксономически удаленных друг от друга групп. Ретровирусы, по-видимому, и в природных условиях способны осуществлять горизонтальный перенос генов у млекопитающих, а с помощью Ti-плазмид происходит горизонтальный обмен генами и у растений. Перемещение генетической информации и изменение характера ее экспрессии возможны и в пределах самих одноклеточных и многоклеточных организмов под действием разнообразных мобильных генетических элементов, а также при воздействии мутагенных факторов окружающей среды.

Приведенные примеры показывают, что в природе обмен блоками генов, отдельными генами и их фрагментами как в пределах геномов, так и между различными геномами и организмами – обычное явление. В результате этих событий переносимые гены не только сохраняют свою способность к экспрессии в новом генетическом окружении, но и могут значительно менять ее уровень, что часто сопровождается характерным изменением фенотипа организмов.

Образование новых сочетаний генов и их частей в природных условиях, по-видимому, не носит целенаправленного характера, и лишь жесткая проверка естественным отбором может оценить жизненную значимость таких преобразований геномов. Однако сознательное использование в лабораторных условиях основных генетических принципов, лежащих в основе природных перемещений генов, позволило разработать более эффективные системы передачи генетической информации между организмами и приступить к беспрецедентным по информативности исследованиям генетических явлений на молекулярном уровне. У нас на глазах произошло рождение нового направления в молекулярной биологии – генной инженерии, значение которого не ограничивается результатами тех или иных фундаментальных и прикладных исследований. Несомненно, именно с этого момента начался новый этап эволюции биосферы Земли, все последствия которого мы в настоящее время не в состоянии предвидеть.

Необходимость манипулирования генами диктуется конкретными задачами фундаментальных и прикладных исследований. Для понимания молекулярных механизмов функционирования отдельных генов и взаимосвязанных генетических систем большое значение имеет работа с изолированными генами. Такие исследования позволяют определить границы генов, выделить их в чистом виде и идентифицировать элементы структуры, существенные для функционирования. Доказательством функциональной значимости выделенного участка генома может быть только его нормальная экспрессия в модельной генетической системе. Поэтому следующим этапом исследования выделенного гена всегда является перемещение его в такую генетическую систему, где экспрессия гена легко обнаруживается. Результаты экспрессии оценивают либо по появлению белкового продукта, кодируемого исследуемым геном, либо по изменению функций биологической системы вследствие появления в ней новой ферментативной или другой активности, например по компенсации присутствующей в этой системе мутации. Таким образом, в результате исследования структуры конкретного гена и моделирования его экспрессии в искусственной генетической системе можно понять особенности его функционирования в живом организме. Подобный подход может быть успешно применен как к известным генам, которые выделяются целенаправленно, так и к неидентифицированным ранее последовательностям нуклеотидов, функциональную значимость которых определяют лишь после выделения их в чистом виде. Последний подход реализуется в так называемой обратной генетике.

В настоящее время с помощью методов генной инженерии получены данные о структуре и функционировании генов разнообразных организмов, что дало возможность перейти на качественно новый уровень генетических исследований. Это, во-первых, возможность переноса гена в новое для него генетическое окружение с дальнейшей его экспрессией, что ведет к изменению свойств организма, в геном которого вводится ген (например создание продуцентов биологически активных веществ или трансгенных животных), а также осуществление генотерапии наследственных и приобретенных заболеваний путем искусственного замещения мутантных аллелей. Во-вторых, стало реальным конструирование новых генов путем объединения in vitro как известных, так и новых, искусственно синтезированных последовательностей нуклеотидов. Этот подход используется в белковой инженерии для исследования функциональной значимости отдельных аминокислот и доменов в полипептидных цепях ферментов, а также для создания новых белков. В-третьих, в современной биотехнологии появилась возможность применять изолированные гены в составе генно-инженерных конструкций для получения пищевых продуктов и биологически активных веществ белковой природы.

Поскольку в экспериментальных условиях невозможно работать с одной копией гена, получение необходимого числа идентичных копий гена или его частей является первой и одной из основных задач генной инженерии. Для ее решения используют метод молекулярного клонирования. Сущность метода заключается в том, что нуклеотидная последовательность, которую необходимо выделить или размножить, ковалентно встраивается в самореплицирующиеся молекулы нуклеиновой кислоты, называемые векторами. Далее такая последовательность нуклеотидов в составе вектора вводится в клетки про- или эукариотического организма, и эти гибридные клетки в селективных условиях, обеспечивающих сохранение вектора внутри клеток, выращивают на питательной среде. В результате образуется клон клеток, теоретически содержащих идентичные векторные молекулы с одной и той же вставкой чужеродной последовательности нуклеотидов. Поскольку объединение молекул клонируемой последовательности нуклеотидов и вектора является не чем иным, как рекомбинацией in vitro, такие гибридные молекулы называют рекомбинантными молекулами. В настоящее время разработаны многочисленные методы, позволяющие выделять определенные последовательности нуклеотидов из сложной смеси фрагментов хромосомной ДНК, а также осуществлять обмен между строго определенными фрагментами генов и другими последовательностями нуклеиновых кислот. Во всех этих реакциях, как правило, используются высокоочищенные препараты нуклеиновых кислот и ферментов нуклеинового обмена, особенности использования которых будут кратко рассмотрены ниже.

Большинство ферментов, применяемых для молекулярного клонирования нуклеиновых кислот, участвует в метаболизме нуклеиновых кислот in vivo. Это означает, что генная инженерия в своем развитии опирается на достижения исследований ферментных систем метаболизма нуклеиновых кислот и существует благодаря возможности получения таких ферментов в высокоочищенном состоянии. В то же время сам процесс клонирования и исследования клонированных последовательностей нуклеотидов сводится в основном к последовательному проведению in vitro определенных ферментативных реакций с использованием очищенных ферментов и их субстратов – нуклеиновых кислот.

При очистке ДНК и РНК в основном используются одни и те же приемы. Различия в методах их фракционирования определяются значительно большей чувствительностью молекул РНК к гидролитическому расщеплению из-за присутствия у рибонуклеотидов, входящих в состав РНК, свободных 2'-ОН групп, их более низкой молекулярной массой и наличием у одноцепочечных молекул характерной (компактной) пространственной структуры. Для выделения нуклеиновых кислот в нативном состоянии необходимо соблюдать, по крайней мере, две предосторожности: следует использовать мягкие условия разрушения тканей биологического объекта, содержащего изучаемые нуклеиновые кислоты, и инактивировать гидролитические ферменты (ДНКазы или РНКазы) до того, как они успеют гидролизовать молекулы нуклеиновых кислот. С учетом этого ингибиторы нуклеаз вводятся в буферные растворы до разрушения клеток или тканей. В качестве ингибиторов нуклеаз используют как неспецифические денатурирующие агенты (ионные детергенты, гидроокись ртути, гуанидинхлорид, гуанидинизотиоцианат, фенол, хлороформ и т.п.), так и специфические ингибиторы, например ингибитор РНКазы из плаценты человека или ванадиевые комплексы рибонуклеозидов.

Работу двухцепочечной геномной ДНК (особенно ДНК эукариотических клеток) сильно усложняют значительная молекулярная масса и высокая жесткость выделяемых молекул. Следствием этого являются большая вязкость растворов высокомолекулярной ДНК и легкость ее фрагментации в растворах. В связи с этим при выделении высокомолекулярной ДНК допускается лишь мягкое перемешивание ее раствора в процессе депротеинизации (освобождения от белков). Для этого на первых этапах очистки обычно применяют протеолитические ферменты (протеиназу К из Trirachium album или проназу из Streptomyces griseus), фенол и хлороформ. Поскольку при освобождении от белков происходит одновременная очистка ДНК и РНК, для освобождения от примесей РНК применяют высокоочищенные препараты РНКаз без примесей ДНКаз (чаще всего панкреатическую РНКазу), а в случае выделения РНК – ДНКаз, не загрязненных РНКазами.

Разделение ДНК и РНК центрифугированием в градиенте плотности CsCI и сахарозы. Высокоэффективным методом разделения нуклеиновых кислот, широко используемым при их очистке, является центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия. В этом случае высокая ионная сила буферного раствора в центрифужных пробирках способствует диссоциации комплексов белков и нуклеиновых кислот, и разделение макромолекул происходит на основании их различий в плавучей плотности. Перемещение макромолекул во время центрифугирования происходит до тех пор, пока они не достигнут зоны раствора CsCl с плотностью, равной их плавучей плотности. В этой зоне происходит их концентрирование. Метод центрифугирования в градиенте плотности CsCI в присутствии бромистого этидия используется в генной инженерии для получения векторных плазмид в препаративных количествах. Он позволяет отделять суперскрученные молекулы ДНК от релаксированных и линейных, так как их плавучие плотности заметно различаются из-за разного количества молекул бромистого этидия, интеркалированного в эти топологические изомеры плазмидной ДНК. В практической генной инженерии для очистки векторных плазмид центрифугирование в градиенте плотности CsCI в настоящее время используется редко. В целях обычного применения рекомбинантных ДНК, в том числе для молекулярного клонирования, построения рестрикционных карт и определения последовательности нуклеотидов (секвенирования), разработаны методы минипрепаративного выделения. В одном из них суперскрученные молекулы рекомбинантных плазмидных ДНК легко отделяются от линейных молекул хромосомной и плазмидной ДНК в процессе щелочной денатурации с последующей быстрой нейтрализацией раствора. При этом в основном успевают ренатурировать только суперскрученные молекулы ДНК, так как две их цепи остаются физически связанными друг с другом в процессе денатурации. Образовавшийся комплекс денатурированной ДНК и белков отделяется от плазмидной ДНК центрифугированием, а от основной массы РНК освобождаются переосаждением в присутствии высокой концентрации LiCl.

Широко распространенным методом фракционирования нуклеиновых кислот по размерам молекул является центрифугирование в градиенте концентрации глицерина.

Электрофоретическое и хроматографическое разделение нуклеиновых кислот. Для дополнительной очистки плазмидной ДНК иногда применяют гель-фильтрацию на Сефакриле S1000 (крупнопористый синтетический аналог сефадекса), а также электрофорез в агарозном геле. Следует отметить, что электрофорез в агарозном, полиакриламидном или смешанном агарозно-полиакриламидном гелях используют для определения размеров и выделения небольших фрагментов двухцепочечной ДНК, образующихся под действием эндонуклеаз рестрикции или во время секвенирования ДНК. Проявление фрагментов в этом случае проводят с помощью бромистого этидия, интеркалирующего между основаниями ДНК и флуоресцирующего в ультрафиолетовом свете. Более чувствительными методами обнаружения фрагментов ДНК в гелях являются окраска серебром, авторадиография и введение флуоресцентной метки.

Отдельно следует упомянуть метод аффинной хроматографии на олиго(dТ)-целлюлозе, используемый для специфической очистки эукариотических мРНК, большинство из которых содержит на 3'-конце поли(А)-последовательность. В олиго(dТ)-целлюлозе последовательности олиго(dТ)_12-18 ковалентно присоединены к молекулам целлюлозы своими 5'-концевыми фосфатными группами. При использовании этого метода фракцию суммарной РНК наносят на колонку с олиго(dT)-целлюлозой в условиях, при которых происходит гибридизация поли(А)-последовательностей мРНК с комплементарными им последовательностями олиго(dТ)-целлюлозы. После отмывания несвязавшихся со смолой молекул РНК, большинство из которых являются рРНК и тРНК, фракцию поли(А)-РНК элюируют, прогревая колонку до температуры плавления поли(А)•олиго(dТ)-гибридов или разрушая гибриды понижением ионной силы элюирующего раствора.

Все перечисленные выше способы очистки и фракционирования нуклеиновых кислот позволяют получать лишь относительно короткие последовательности нуклеотидов. Однако в настоящее время в арсенале молекулярной биологии имеются методы, которые дают возможность выделять в гомогенном состоянии последовательности нуклеотидов, эквивалентные целым хромосомам. Одним из таких методов является электрофорез в импульсном электрическом поле (pulsed field gel electrophoresis – PFGE), с помощью которого удается препаративно разделять ДНК целых хромосом дрожжей. Другой эффективный метод, с помощью которого можно фракционировать метафазные хромосомы млекопитающих, – это сортировка хромосом с помощью проточной цитофлуориметрии. Метод позволяет получать индивидуальные метафазные хромосомы в количестве, достаточном для конструирования клонотек генов индивидуальных хромосом.

Все упомянутые выше методы очистки нуклеиновых кислот при использовании в качестве исходного материала клеток бактерий, животных или растений дают в руки исследователей сложную смесь генов и некодирующих последовательностей нуклеотидов. Для выделения конкретных последовательностей нуклеотидов и работы с ними необходимо использовать многочисленные ферменты. Свойства некоторых ферментов, широко используемых в генной инженерии, кратко рассмотрены ниже.