7.5.3.Проточные системы

Бесклеточные системы биосинтеза белка позволили генной инженерии получать экспрессию изолированных генов, не прибегая к помощи живых клеток. До недавнего времени все обсуждавшиеся выше бесклеточные системы существовали только в аналитическом варианте и были функционально активны на протяжении короткого времени (40–60 мин). Для всех описанных выше систем характерен малый выход синтезируемого белка (не более 1 мкг на 1 мл экстракта), и на 1 молекулу мРНК в них синтезируется лишь одна–две молекулы полипептида.

Значительный прогресс в этой области исследований был достигнут в лаборатории А.С. Спирина в 1988 г. Здесь с помощью простых усовершенствований удалось получить эффективную бесклеточную белоксинтезирующую систему. В их модификации бесклеточные экстракты бактериальных или эукариотических клеток помещают в ячейку, закрытую с двух сторон полупроницаемыми мембранами. Размер пор позволяет проходить через мембраны вместе с током жидкости низкомолекулярным химическим веществам и небольшим белкам. Содержимое ячейки, в которой имеются все компоненты, необходимые для бесклеточной трансляции, инкубируют при обычной температуре. При этом с одной стороны в такую ячейку-реактор со скоростью ~1 мл/ч непрерывно поступают ингредиенты, расходуемые в процессе биосинтеза белка (аминокислоты, АТР, GTP), а с другой – из нее выходят синтезированные белковые продукты (если их молекулярная масса и отсутствие способности к агрегации позволяют пройти через поры мембраны).

Такое простое усовершенствование бесклеточной системы сильно изменило характер ее функционирования. Биосинтез белка в ней может продолжаться непрерывно в течение нескольких десятков часов, причем на одну молекулу транслируемой мРНК синтезируются сотни копий полипептидных цепей белков, суммарный выход которых может достигать 200 мкг и более на 1 мл бесклеточного экстракта.

С разработкой проточной бесклеточной белоксинтезирующей системы стало возможным проводить биосинтез рекомбинантных белков в препаративных количествах in vitro. Такая система позволяет синтезировать в больших количествах полипептиды, подверженные быстрой внутриклеточной деградации протеиназами или образующие тельца включения в живых клетках. Проточная система может быть полезна также для получения белков, обладающих цитотоксической активностью, или других рекомбинантных полипептидов, для которых нежелательны артефактные посттрансляционные модификации, происходящие in vivo. Недавно в таких системах удалось получить препаративные количества функционально активного интерлейкина 6 человека.

7.6.Другие современные методы исследования генов

Основным методическим достижением генной инженерии в исследовании генов является разработка способов выделения индивидуальных генов и экспрессии их в новом генетическом окружении в гомологичных и гетерологичных генетических системах. Именно эти аспекты генной инженерии были подробно рассмотрены в предыдущих разделах. Однако для изучения тонкой структуры уже клонированных генов, их картирования на хромосомах и исследования механизмов регуляции экспрессии были разработаны другие не менее эффективные методы.