2.1. Векторні системи експресії для дріжджів

Існує три типи експресуючих векторів на основі дріжджів Saccharomyces cerevisiae: 1) плазмідні вектори; 2) інтегруючі вектори; 3) штучні дріжджові хромосоми.

Плазмідні вектори для S.cerevisiae (рис.3) сконструйовані на основі природної дріжджової плазміди довжиною 6300 п.н., що одержала назву 2μ-кільце, здатна до самостійної реплікації завдяки наявності ділянки ori та білків підтримуючих ампліфікацію плазміди на постійному рівні (ділянки М1 та М2). Для проведення попередніх операцій в E.coli вектор сконструйований як бінарний та містить фрагменти плазміди pBR322: ділянку ori E.coli та селективний маркер Amp. В якості селективних маркерів для дріжджових клітин використовуються гени, що кодують ферменти біосинтезу лейцину (leu), триптофану (trp), гістидину (his), аргініну (arg), урацилу (ura). Кодуюча ДНК знаходиться між промотором та сигналами термінації-поліаденілірування S.cerevisiae (Р і Т). Для забезпечення секреції синтезованих білків із дріжджових клітин необхідно використовувати спеціальні системи секреції. В S.cerevisiae таку роль відіграє так званий про-α-фактор – лідерна (сигнальна) послідовність гену α-фактору парування дріжджів , який розміщується перед к-ДНК.

Інтегруючі вектори обов’язково містять послідовності, комплементарні певним ділянкам хромосомної ДНК. Однак, такі векторні системи для S.cerevisiae не одержали широкого розповсюдження.

Частіше використовується інтегруючий експресуючий вектор на основі метилотрофних дріжджів Pichia pastoris (рис.4). Наявність метанолу регулює активність гену алкогольоксидази, яка синтезується тільки в його присутності в великій кількості (до 30% всіх клітинних білків). Вектор містить послідовності плазміди pBR322 (ori для E.coli та Amp), що полегшує клонування. Для самостійної реплікації вектор містить ділянку ori для P.pastoris. Інтеграція в геном P. pastoris відбувається в результаті подвійного кросинговеру .

Штучна дріжджова хромосома (YAC) на основі S.cerevisiae (рис.5) містить сайт ініціації реплікації для E.coli та селективний маркер Amp; фрагмент дріжджової

Рис. 5 Штучна дріжджова хромосома (YAC) на основі S.cerevisiae

BamHI, SmaI, лужна фосфотаза

+

к-ДНК, лігування

ДНК для забезпечення автономної реплікації, центромерну ділянку дріжджової хромосоми та послідовності, що виконують функції теломер та стабілізують лінійну форму. Між цими послідовностями знаходяться сайти рестрикції для вбудування послідовностей, що клонуються.YAC системи надзвичайно стабільні і використовуються для клонування фрагментів ДНК більше 100 т.п.н.

2.2. Векторні системи на основі Ті-плазмід

Грамнегативна грунтова бактерія Agrobakterium tumefaciens є фітопатогеном, який може трансформувати рослинні клітини і викликати утворення коронкових галів (наростів пухлинної тканини в місцях зараження). До цих бактерій чутливі дводольні рослини.

Вивчення Agrobakterium tumefaciens показало, що агентом, який викликає трансформацію клітин є плазміда. Всі властивості бактерій зумовлені наявністю в них Ті-плазмід. Ці плазміди представляють собою кільцеві молекули, що складають 3-5% від розміру хромосоми агробактерії (200 т.п.н.), мають сайт реплікації в А. tumefaciens і генетичний маркер – опін певного типу (амінокислота, синтез якої притаманний тільки агробактеріям з Ті-плазмідами).

Утворення коронкового галу починається з проникнення, інтеграції в геном рослинної клітини та експресії специфічної ділянки бактеріальної плазмідної ДНК, що називається трансформуюча ДНК, або Т-ДНК.

Т -ДНК містить дві фланкуючі послідовності: ліву і праву, які забезпечують інтеграцію Т-ДНК в рослинну хромосому; гени, кодуючі ферменти синтезу фітогормонів та ген, кодуючий синтез опіну. Поза межами Т-ДНК знаходиться ділянка необхідна для транспортування та інтеграції Т-ДНК (кластер генів vir), гени, що кодують катаболізм опінів та ділянка ori.

На основі Ті-плазмід створено дві векторні системи.

Бінарний клонуючий вектор (рис.6) містить ori для E.coli та А.tumefaciens, селективний маркерний ген для E.coli та A.tumefaciens (Amp або Kan) , рослинний селективний ген (Марк.) та ген, експресії якого очікують, вбудовані в Т-ДНК. Бінарний вектор не містить генів vir, тому всі стадії клонування проводять в E.coli, після чого вводять в штам-реціпієнт A.tumefaciens, що несе модифіковану плазміду, яка містить повний набір генів vir, але з неї видалена частина або вся Т-ДНК. Ця плазміда допомагає переходу Т-ДНК з бінарного вектора в хромосомну ДНК рослини.

Коінтегративний клонуючий вектор (рис.7) містить сайт ініціації реплікації тільки для E.coli і не може самостійно існувати в A.tumefaciens. Він також містить селективний маркер, що використовується або в E.coli, або в A.tumefaciens (Amp або Kan), праву фланкуючу послідовність Т-ДНК (П), рослинний селективний маркер (Марк.), чужорідний ген та ділянку ДНК, гомологічну ділянці ДНК допоміжної Ті-плазміди (А1). Допоміжна неонкогенна Ті- плазміда містить ліву фланкуючу послідовність Т-ДНК (Л), гени vir та сайт ініціації реплікації для A.tumefaciens.

Коінтегративний вектор та неонкогенна плазміда містять гомологічні ділянки, що створюють сайт для гомологічної рекомбінації in vivo. Гомологічна рекомбінація коінтегративного клонуючого вектора з модифікованою Ті- плазмідою дає рекомбінантну плазміду, яка несе в собі клонований ген та рослинний маркерний ген, що фланковані правою та лівою кінцевими послідовностями Т-ДНК, а також містить гени vir, які необхідні для переносу Т-ДНК рослинну клітину - господаря.