1.Вектори для переносу днк в еукаріотні клітини
1.1. Плазмідні вектори
П
лазміди
– це позахромосомні дволанцюгові
кільцеві молекули ДНК, які здатні до
автономної реплікації. Плазміди є
практично в усіх бактерій. Деякі з них
містять гени стійкості до антибіотиків
або дезинфікуючих засобів, інші – гени,
що забезпечують перенос їх з клітини
до клітини та інш. Розміри плазмід можуть
бути від 1 до 500 т.п.н. Кожна плазміда
містить сайт початку реплікації ori,
без якого самостійна реплікація в
клітинах-господарях була б неможлива.
Перші ефективні вектори для клонування фрагментів чужорідної ДНК були одержані з використанням бактеріальних плазмід. Велика серія векторних плазмід, позначена символом pBR, створена на основі реплікона природної плазміди ColEI. Найбільш широко використовується плазміда pBR322 (рис.1), що складається з 4363 п.н. Послідовність нуклеотидів pBR322 повністю визначена.
Плазміда містить гени стійкості до тетрацикліна Tet і ампіциліна Amp. Обидва ці гени є маркерами. Плазміда pBR322 містить також ділянку ДНК ori, з якої починається реплікації. Треба мати на увазі, що включення в плазміду фрагментів ДНК по сайтам рестрикції, що містяться в генах Аmр або Тet (наприклад PstI або BamHI), буде порушувати цілісність цих генів. Таким чином стає можливим проведення швидкого відбору рекомбінантних плазмід на селективних поживних середовищах.
1.2. Вектори на основі фага
Бактеріофаг λ являє собою дволанцюгову молекулу ДНК довжиною приблизно 45 т.п.н., заключену в білковий капсид. Розвиток бактеріофага λ після проникнення в бактерію E.coli може відбуватись двома шляхами. Якщо має місце літичний цикл, то фаг інтенсивно розмножується і приблизно через 20 хв. клітина руйнується з утворенням фагових частинок. Якщо ж розвиток подій відбувається лізогенним шляхом, фагова ДНК інтегрує в хромосому бактерії у вигляді профагу та реплікується разом з нормальними бактеріальними генами. Під дією несприятливих умов (наприклад УФ-опромінення) профаг активується, і починається літичний шлях розвитку.
Вектори на основі фага отримали широке розповсюдження. Фагові частинки здатні проходити літичний цикл розвитку всередині бактеріальних клітин і, відповідно, утворювати в популяції бактерій стерильні плями, при чому всі фагові частинки однієї плями є клоном ідентичних фагових частинок. Такі плями містять в концентрованому вигляді як самі фагові частинки, так і продукти метаболізму інфікованих бактеріальних клітин, що дозволяє ідентифікувати клоновані послідовності ДНК.
Існує декілька принципів конструювання векторів на основі фага . В середині молекули -ДНК довжиною 45т.п.н. міститься ділянка (15т.п.н.), що не є необхідною для літичного розвитку бактеріофага, тому її можна замінити на фрагмент чужорідної ДНК і здійснити клонування шляхом розмноження рекомбінантного бактеріофага. Рекомбінантні ДНК, які містять фрагменти чужорідної ДНК, що не відповідають оптимальному розміру, не спаковуються і не клонуються. Фрагмент фагової ДНК обмежений з двох боків послідовностями полілінкера, що містять сайти рестрикції ЕкоRI, ВаmНI, SalGI, в які вбудовуються фрагменти чужорідної ДНК. Ємність фагових векторів 15-25 т.п.н.