Задачі для самостійного рішення

1. На ділянку ДНК миші подіяли рестриктазою MbaII та одержали фрагменти довжиною від 25 т.п.н. до 45 т.п.н. Запропонуйте вектор для створення клонотеки цієї ДНК в бактеріях E.coli.

2. Який із запропонованих олігонуклеотидів:

1) 5′ GAACCGGTTTAACGACCATGGAGAAAA 3′

2) 5′ CAACCGGAGCTTTAAGACCATCGGAAA 3′

3) 5′ GAACCGGAGCTTTAAGACCATTGAAAA 3′

можна використовувати в якості зонду для скринінга ДНК такого складу:

5′ AGCACTGGAATTTCCGATGGTCTTAAAGCTCCGGTTCGA 3′

3. При проведенні експериментів для одержання ділянки ДНК, що кодує білок інтерферон, була сконструйована бібліотека ДНК для лімфоцитів людини. Бібліотеку ДНК ділили на 8 груп, присутність інтерферону в кожній групі перевіряли гібридизацією з м-РНК. Після ідентифікації групи клонів її знов ділили на підгрупи та повторювали визначення. Знадобилось 4 таких цикли. Скільки всього клонів було перевірено?

4. Скільки векторів на основі фагу λ необхідно, щоб створити репрезентативну клонотеку генів еукаріотичної ДНК довжиною 15000 т. п. н.?

5. Для аналізу ділянки ДНК довжиною 160 т. п. н. методом „прогулянка по хромосомі” було обрано вектор на основі фага λ. Побудуйте схему дослідження .

6. Побудуйте схему дослідження методом „прогулянка по хромосомі” молекули ДНК довжиною 240 т. п. н. Покажіть положення унікальних ділянок.

7. Запропонуйте вектор для створення бібліотеки генів молекули ДНК довжиною 3 млн. п.н.

Відповіді

1. космідний.

2. 2)

3. 4096

4. 1000

5. ≈ 10 унікальних послідовностей

6. вектор на основі фага λ, або більшої ємності

7. дріжджова штучна хромосома, інші над’ємні вектори

Вектори клонування

Технологія рекомбінантних ДНК – це сукупність експериментальних процедур, що дозволяє здійснити перенос генетичного матеріалу від одного організму в інший, і найчастіше проводиться за такою схемою:

• з організму донора екстрагують необхідну ДНК, піддають її ферментативному гідролізу (розщеплюють) і лігують (зливають) з іншою ДНК (вектор для клонування) з утворенням нової, рекомбінантної молекули;

• отриману рекомбінантну молекулу ( конструкція “клонуючий вектор”- чужорідна ДНК) вводять в клітину–господаря (реципієнта), де вона реплікується і передається нащадкам;

• ідентифікують , проводять скринінг і одержують необхідний продукт.

В цьому процесі велике значення має правильний вибір вектора.

Вектор – молекула ДНК, що використовується в генній інженерії для переносу фрагментів нуклеїнових кислот від організму донора в організм реципієнту. Молекула-вектор обов’язково повинна мати такі властивості:

по-перше, будь-який вектор повинен довгий час існувати в популяції клітин–господарів, тобто реплікуватись автономно або з хромосомами клітин;

по-друге, структура векторної молекули повинна допускати вбудування в неї чужорідної послідовності нуклеотидів без порушення її функціональної цілісності ;

по-третє, в будь-якому векторі повинні бути біохімічні або генетичні маркери, що дозволяють виявляти його присутність в клітинах.