Исходный уровень знаний.

Для усвоения материала темы необходимо повторить:

- выделение чистой культуры аэробов и анаэробов;

- питательные среды.

Цель занятия.

1. Изучить принципы идентификации чистых культур по морфологическим, культуральным, биохимическим и другим свойствам.

2. Показать разнообразие ферментов у микроорганизмов и возможности их использования для идентификации.

План изучения темы.

1. Выделение чистой культуры (по дням);

2. Ферменты бактерий.

3. Питательные среды, для изучения биохимической активности бактерий.

4. Действие на микроорганизмы физических и химических факторов.

После изучения темы студент должен уметь.

1. Охарактеризовать колонии микроорганизмов.

2. Оценивать биохимическую активность микроорганизмов.

Дополнительный материал к занятию.

Разные виды бактерий, в том числе имеющие одинаковую морфологию, могут отличаться по ферментативной активности. Поэтому невозможно такие виды идентифицировать только по их морфологии. После выделения чистой культуры бактерий изучают их ферментативную активность (биохимические свойства). Для этого применяются дифференциально-диагностические среды, например, среды Гисса, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева в чашках Петри. Последние три среды применяются для дифференциации бактерий кишечной группы по их способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде (индикатор рН). Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например, кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы образуются кислые продукты и индикатор изменяет свой цвет. Поэтому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашены соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева - в красный цвет, на среде Левина в черно-синий. Если же на эти среды посеять бактерии, которые не сбраживают лактозу, реакция среды останется слабо-щелочной, и цвет индикатора не изменится. Поэтому, колонии бактерий на этих средах будут бесцветными. Среду Плоскирева можно отнести также к элективным средам для выделения палочек дизентерии, так как эта среда содержит соли желчных кислот, задерживающих рост кишечной палочки, и краситель бриллиантовый зеленый, задерживающий рост воздушной кокковой флоры.

Дифференциально-диагностические среды Гисса («пёстрого» ряда) готовятся на основе жидкой среды (пептонной воды) или полужидкого мясо-пептонного агара. Среды Гисса содержат какой-либо углевод или многоатомный спирт (лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу) и индикатор, который изменяет свой цвет в кислой среде. В пробирку с жидкой средой Гисса помещён стеклянный поплавок. Если на среду Гисса посеять микроб, который сбраживает данный субстрат с образованием кислоты и газа, то есть до конечных продуктов, то среда изменит свой цвет, в полужидкой среде появятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде - пузырёк газа в поплавке. При сбраживании субстрата только до промежуточных продуктов (до кислоты) происходит только изменение цвета среды.

Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого - трёхсахарный агар с мочевиной. Одна пробирка среды Олькеницкого заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, сахарозой и глюкозой. Среда готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1%), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит натрия и индикатор. Среду после стерилизации в расплавленном виде наливают в пробирку и дают застыть так, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и затем уколом в столбик. При сбраживании углеводов, которые содержатся в среде в большем количестве (лактозы, сахарозы) изменяется цвет всей среды, при сбраживании только глюкозы изменяется цвет столбика, а скошенная часть остаётся без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. Культуры, расщепляющие мочевину с образованием аммиака, дают щелочную реакцию. При этом происходит нейтрализация кислоты, образующейся при сбраживании углеводов, и цвет среды не изменяется. Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Патогенные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бактерий к образованию сероводорода по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид чёрного цвета.

Протеолитические ферменты у бактерий изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном и на некоторых полиуглеводных средах (например, на среде Клиглера). Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода.

Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой (при взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца), или на средах, в состав которых входят соли железа или свинца, которые при взаимодействии с сероводородом дают чёрное окрашивание самой среды или выросших колоний (среды Вильсона-Блера, Клиглера и т.д.).

Для обнаружения индола по способу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги, смоченные горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушенные, помещают между стенкой пробирки с питательным агаром и пробкой. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобретает розовый цвет. Другой, более чувствительный, метод обнаружения индола позволяет концентрировать индол на поверхности среды ксилолом или эфиром, а добавление раствора Ковача (парадиметиламинобензальдегида) приводит к образованию красного кольца. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы.

Наличие аммиака определяют по посинению розовой лакмусовой бумажки, помещённой между стенкой и пробкой засеянной пробирки.

Желатиназа. При посеве уколом в желатин некоторые микробы (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и др.) при комнатной температуре (20-22°С) разжижают его, причём различные виды микробов дают характерную для них форму разжижения (послойно, в виде гвоздя, ёлочки и т.д.).

Другие протеолитические ферменты:

– при посеве на свёрнутую сыворотку вокруг колоний появляются углубления (разжижение);

– в молоке происходит расщепление сгустка казеина с образованием пептона, в результате чего оно приобретает желтоватый цвет (пептонизация молока).

Наличие уреазы у бактерий определяют на среде с мочевиной и индикатором фенол-рот (начальный цвет среды – жёлтый). При расщеплении мочевины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН в щелочную сторону и изменяет цвет индикатора на красный.

Образования ацетоина (ацетил-метил-карбинола) при ферментации глюкозы проводится с помощью реакции Фогес-Проскауэра. Добавление к культуре 40% КОН и 5% альфа-нафтола даёт красное окрашивание, т.е. в щелочных условиях ацетоин образует с альфа-нафтолом соединение красного цвета – ацетилметилкарбинол.

Утилизацию цитрата с целью выявления способности бактерий использовать его как источник углерода проверяют на среде Симмонса. Среда содержит набор солей, агар, неорганический источник азота, цитрат натрия, индикатор бромтимоловый синий. При наличии у бактерий фермента цитрат-пермеазы среда подщелачивается и окрашивается в синий цвет. При отсутствии продукции бактериями этого фермента среда остается зелёной.

Каталаза – это фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1% раствором перекиси водорода. На предметное стекло помещают каплю перекиси водорода и суспендируют в ней небольшое количество культуры микроорганизмов, выращенной на плотной среде.

Обнаружение цитохромоксидазы у аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов проводится путём нанесения и растирания петли культуры на индикаторную бумажку, пропитанную спиртовым раствором альфа-нафтола и 1% водным раствором ментола. При положительном результате бумажка синеет.

Выявление нитратредуктазы характерно в основном для факультативных анаэробов. Фермент восстанавливает нитраты в нитриты. Нитрат является конечным акцептором электронов. В кислой среде нитраты окисляют йодид калия. Выделившийся йод, реагируя с крахмалом, даёт синее окрашивание среды.

Тест окисления/ферментации глюкозы (в аэробных/анаэробных условиях) устанавливается на среде Хью-Лейфсона. В среде содержится агар, соли, пептон, глюкоза и индикатор бромтимоловый синий. Посев осуществляют уколом в столбик питательной среды в две пробирки. Для создания анаэробных условий после посева среда в одной из пробирок заливается слоем стерильного вазелинового масла. Посев выращивают 3-4 суток. Образование кислоты из глюкозы изменяет зелёный цвет среды в жёлтый. При окислении глюкозы изменение цвета происходит в верхней части пробирки без вазелинового масла. При ферментации меняется цвет среды под слоем вазелинового масла (в анаэробных условиях). Тест используется для дифференциации аэробных бактерий от анаэробов и факультативных анаэробов. Аэробы (например, Pseudomonas aeruginosa) расщепляют глюкозу в аэробных условиях, то есть только окисляют глюкозу, но не ферментируют её; анаэробы (например, Clostridium perfringens) утилизируют глюкозу только в анаэробных (т.е. ферментируют). Факультативные анаэробы (например, Escherichia coli, Staphylococcus aureus) утилизируют глюкозу в аэробных и анаэробных условиях.

Для экспресс-метода определения ферментативной активности микроорганизмов применяются микротестсистемы и система индикаторные бумажные (СИБ).

Диагностические микротест-системы (МТС), типа API-20-Е (для энтеробактерий), API-32-Gr+, ID32 GN, Enterotube и другие представляют собой полистироловые пластины с лунками, или планшеты, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды или только субстраты и индикаторы. Стерилизацию МТС проводят ультрафиолетовым облучением. Существует два основных типа таких систем. Это индивидуальные системы, рассчитанные на идентификацию одной культуры. К ним относятся тест-системы ПБДЭ, ПБДС (Россия), системы API (Франция) и многие другие. Второй тип систем основан на использовании многорядных планшетов, позволяющих одновременно проводить идентификацию нескольких культур. К системам этого типа относятся тест-системы фирмы Lachema (Чехия), ММТ Е (Россия), Enterotube II (США) и др. В каждую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определённой густоты. В контрольные ячейки наливают физиологический раствор. Инкубация тест-систем проводится в обычных термостатах или в специальных термостатируемых устройствах, входящих в комплект автоматизированных систем, где учёт результатов и их интерпретация осуществляется автоматически с помощью компьютера (Vitek, BioMerieux, Франция). Результат учитывают после 3–4-часовой инкубации в термостате визуально или при использовании автоматизированной компьютерной системы по изменению цвета индикатора. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Системы индикаторные бумажные (СИБ) представляют собой наборы бумажных дисков для выявления самых разнообразных ферментов бактерий. Диски пропитаны субстратом (углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и другими веществами), а также содержат индикатор. Полную петлю исследуемой культуры или каплю густой микробной взвеси вносят в стерильный физиологический раствор (в некоторых случаях в забуференный: рн 5,4-5,6) либо в 1% пептонную воду и помещают в эту пробирку соответствующий диск. В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят. Для определения сероводорода диск помещают в пробирку на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность. После инкубации в термостате оценивают результаты тестов по изменению цвета среды и диска. Утилизация вещества приводит к изменению цвета индикатора. Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный – через восемнадцать–двадцать четыре часа. Имеются наборы, которые содержат от десяти до тридцати тест-бумажек.