Экстр акция бав из растительных тканей

Органы растений – листья, стебли, корни – предва­рительно разрезанные на мелкие части, измельчают на механической мельнице в порошок с размером частиц в 1–2 мм (см. рис.1). Вытяжку готовят путем настаива­ния порошка в 50%–ном этаноле в соотношении 1:20 (1 г растительного порошка настаивают на 20 мл 50%-ного этанола). Экстракцию проводят в течение 24 ч при тем­пературе воздуха +4 °С. Удаление неразрушенных час­тиц, клеток, ядер и прочего проводят путем фильтрова­ния тканевого гомогената или центрифугированием при 7000 g в течение 10–15 мин при температуре 2–4 °С. За­тем прозрачный раствор (фильтрат или супернатант) под­вергают химическим исследованиям.

Приготовление гомогената из растительных тканей

Целое растение или его часть после взвешивания под­вергают гомогенизированию путем механического расти­рания в ступке при постоянном охлаждении. Получен­ную однородную массу центрифугируют. Надосадочную жидкость подвергают исследованию.

Зерновки с влажностью 8–10% и другие сухие части растений измельчают на мельнице (2 г зерновок измель­чают в течение 1 мин). Полученный сухой порошок взве­шивают и растворяют в бидистиллированной воде или другой среде выделения, охлажденной до 0°С, в соотно­шении 1:3 (на 1 г зерновок добавляют 3 мл охлажденной среды выделения). После перемешивания исследуемый образец центрифугируют при 7000 g. Надосадочную жид­кость (супернатант) используют для биохимических ис­следований.

Приготовление гомогената из тканей животных

Свежую ткань печени или мышц предварительно мно­гократно промывают 0,9 % раствором NaCl (физио­логический раствор), охлажденным до 0°С, а затем обсу­шивают фильтровальной бумагой и измельчают ножница­ми. На весах взвешивают измельченную ткань и помещают в стакан для гомогенизирования. В случае, если исполь­зуется стеклянный гомогенизатор, зазор между стенкой и пестиком должен быть 0,2–0,3 мм; скорость вращения пестика не должна превышать 800 об/мин. Время измель­чения тканей: печень – 30–40 сек, мышцы – до 60 сек. Если используют механический гомогенизатор, скорость вращения ножей можно доводить до 900 об/мин. Все ра­боты необходимо проводить на холоде, помещая стакан гомогенизатора в чашку со льдом.

Разбавление при гомогенизировании должно прово­диться с учетом содержания определяемого биологиче­ски активного вещества. Так, в случае определения ак­тивности алкогольдегидрогеназы в печени используют разбавление 1:3 или 1:5 (на 1 г сырой ткани добавляют 3 или 5 мл охлажденной среды выделения).

Полученный тканевой гомогенат центрифугируют при 7000 g в течение 10–15 мин (t 0 °C). Надосадочную жидкость (супернатант) подвергают биохимическим исследо­ваниям.

Лабораторная работа № 2. Цветные реакции на белки и аминокислоты

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: ознакомиться с цветными реакциями на белки и аминокислоты.

Теоретические основы занятия

Для аминокислот и белков характерны определенные цветные реакции. Часть этих реакций обусловлена присутствием тех или иных атомных группировок, общих для молекул различных белков, и поэтому такие реакции являются общими цветными реакциями на белки.

Другие реакции связаны с наличием в молекуле белка остатка, какой либо аминокислоты и, следовательно, характерны для белков, в молекулу которых входит данная аминокислота. Эти реакции ценны тем, что с их помощью легко составить общее представление о качественном аминокислотном составе исследуемого белка. Некоторые из цветных реакций на отдельные аминокислоты применены только к свободным аминокислотам, т.е. лишь в растворах, получающихся после гидролиза белков.