15.1. Влияние рН на активность трипсина

Для определения влияния рН на активность трипсина проводят расщепление казеина трипсином при различных значениях рН реакционной смеси. В ходе реакции увеличивается количество аминокислот, которые определяют методом формолового титрования. Источником фермента служит обезжиренный и высушенный препарат поджелудочной железы – панкреатин, содержащий ряд ферментов, в том числе и активный трипсин.

Ход работы

Готовят 3 навески казеина по 100 мг и 3 навески панкреатина по 30 мг. В три колбочки наливают растворы с различными значениями рН:

а) 5 мл 0,1 н NaOH;

б) смесь 5 мл 0,5 % раствора Na₂CO₃ и 0,15 мл 0,1 н раствора NaOH;

в) смесь 5 мл 0,5 % раствора NaHCO₃ и 0,15 мл 0,1 н раствора NaOH.

В каждую колбочку вносят по 100 мг казеина; тщательно размешивают палочкой и быстро измеряют рН с помощью универсальной индикаторной бумаги.

Инкубация. В каждую колбочку вносят по 30 мг панкреатина и проводят инкубацию в течение 25 мин при комнатной температуре, время от времени перемешивая реакционную смесь. Перед окончанием инкубации проверяют рН смесей и ставят колбочки в ледяную воду для прекращения реакции. К охлажденным пробам добавляют по 5 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (CCl₃COOH) для осаждения белков. Через 5 минут отфильтровываю осадок, фильтрат анализируют вместе с контрольной пробой.

Контролем служат пробы с 5 мл 0,1 н NaOH и казеином, в которые до добавления панкреатина приливают 5 мл охлажденного 5 % раствора CCl₃COOH. После удаления осадка фильтрат контрольных проб обрабатывают так же, как и опытные пробы.

Нейтрализация и титрование. Из содержимого каждой колбочки отбирают в другие колбочки по 5 мл трихлоруксусного фильтрата, добавляют к нему по 5 капель 1% раствора фенолфталеина и 5-10 капель 0,1 н NaOH до получения отчетливой розовой окраски раствора. После этого осторожно, по каплям, добавляют, встряхивая после каждой капли, 0,1 н HCl до слабо-розовой окраски.

К нейтрализованным пробам приливают по 2 мл 20% раствора формальдегида. Содержимое колб перемешивают и титруют 0,025 н раствором щелочи.

Расчет активности. Активность трипсина может быть выражена количеством миллиграммов аминного азота, нарастающего за время инкубации:

А =(Б-В)∙0,35

где А - активность трипсина; Б - количество 0,025 н раствора щелочи (в миллилитрах), пошедший на титрование опытной пробы; В- количество 0,025 н раствора щелочи (миллилитрах), пошедший на титрование контрольной пробы; 0,35- количество азота (в миллиграммах), эквивалентное 1 мл 0,025 н раствора щелочи.

Вычисляют средние величины активности трипсина по данным титрования и строят график зависимости активности трипсина от рН: для этого на оси абсцисс откладывают значения рН, а на оси ординат – величины активности трипсина. На основании полученных данных делают вывод об оптимуме рН трипсина.

15.2. Зависимость ферментативной активности амилазы слюны от рН реакции среды

Скорость ферментативных реакций зависит от содержания водород ионов в среде. Концентрация ионов водорода, при которой наблюдается максимальная скорость реакции, называется оптимальной (оптимум рН). При небольшом отклонении от оптимума рН скорость ферментативной реакции замедляется, при резком отклонении - реакция прекращается полностью.

Влияние рН на активность ферментов объясняется тем, что белковая молекула фермента является амфотерным полиэлектриком, каталитический эффект которого зависит от степени ионизации функциональных групп, которые входят в активный центр.