Рекомендации к составлению протокола

Активность -амилазы выражают количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведенной слюны при 37 °С в течение 30 минут до стадии эритродекстрина.

Рассчитывают количество слюны в последней пробирке с желтоватой окраской. Например, если с красно-бурой окраской жидкость была отмечена в 5 пробирке, где слюна разбавлена в 160 раз и куда было прибавлено 2 мл 0,1% раствора крахмала, то 1 мл неразбавленной слюны расщепил бы в 160 раз больше 0,1% раствора крахмала: 1/160 мл слюны расщепляет 2 мл — 0,1% раствора крахмала, 1мл слюны расщепляет х мл 0,1% раствора крахмала, т. е. х = 2∙1:1/160 = 320 мл 0,1% раствора крахмала. Следовательно, 1 мл неразбавленной слюны расщепляет за 30 минут при 37 °С 320 мл 0,1% раствора крахмала. Условно это принимают за 320 единиц -амилазы по Вольгемуту. Результат принято изображать следующим образом: А 37º/30' = 320 ед.

12.2. Количественное определение активности амилазы по приросту мальтозы

Данный метод определения активности амилазы основан на измерении прироста количества мальтозы, которая образуется при действии амилазы на полисахариды — крахмал и гликоген.

Крахмал и гликоген не обладают восстанавливающей способностью, тогда как продукт их гидролиза мальтоза — обладает этим свойством. Реакция идет по уравнению:

(С₆Н₁₀О₅)_n+ Н₂О  С₁₂Н₂₂О₁₁

С₁₂Н₂₂О₁₁ + J₂ + 3NaOH  С₁₁Н₂₁ СOОNa + 2NaJ + 2 Н₂О

В результате реакции йод, добавленный в реакционную смесь, в щелочной среде восстанавливается под действием образующейся мальтозы, превращаясь в бесцветное соединение — соль NaJ. Путем титрования определяют количество йода, эквивалентное данной величине мальтозы, и рассчитывают активность амилазы.

Ход работы

В две колбочки (опытную и контрольную) вносят по 0,1 мл слюны, разведенной в 5 раз, по 0,5 мл фосфатного буфера рН 6,8 и по 0,1 мл 1% раствора NaCl. В контрольную пробу вносят 0,5 мл 5% раствора НС1 и кипятят.

В обе колбочки наливaют 2 мл 2% раствора крахмала, перемешивают и ставят на 30 минут в термостат при 37 С.

Спустя 30 минут в опытную колбочку вносят 0,5 мл 5% НС1 и нагревают до кипения. Затем в обе колбы, добавляют по 15 мл 0,1 н, раствора J₂ и по каплям, все время перемешивая, добавляют 0,5 мл 40% раствора NaOH.

Оставляют пробы стоять 15 минут, а затем в обе колбочки вносят по 10 мл 5% раствора НС1 и выделившийся J₂ титруют 0,05 н. раствором Na₂S₂O₃ до исчезновения сине-фиолетового окрашивания.

Рассчитывают активность амилазы: 1 мл 0,05 н. раствора J₂ эквивалентный 1 мл 0,05 н. раствора Na₂S₂O₃, соответствует 8,57 мг мальтозы. Количество образовавшейся мальтозы

С = (B-D) ∙ 8,57,

где В — количество 0,05 н. раствора Na₂S₂O₃, пошедшее на титрование контрольной пробы; D —количество 0,05 н. раствора Na₂S₂O₃, пошедшее на титрование опытной пробы; 8,57 коэффициент поправки на 0,05 н. раствора Na₂S₂O₃.

Активность амилазы А будет равна:

А= i5,

где 5 — разведение пробы.

12.2. Определение активности уреазы

Предлагаемый метод основан на учете образующегося в процессе реакции аммиака.

Препарат уреазы приготовить заранее (8 г соевой муки или муки семян бобовых растений) заливают 46 мл дистиллированной воды, прибавляют 2 мл 0,1н. раствора НС1 и несколько капель толуола, перемеши­вают и оставляют на ночь, затем фильтруют или центрифугируют, объем фильтрата доводят промывными водами до 50 мл).