5.4.6.1. Действие воды и разбавленных кислот

Ход работы

Берут в две пробирки по 0,2 г роговых стружек или волос. В первую пробирку наливают 5-7 мл холодной воды, во вторую - столько же 2-% раствора серной кислоты. Наблюдают - стружки или волос не растворяются. Содержимое пробирок кипятят; растворение не происходит. Наблюдается некоторое размягчение роговых стружек в горячей воде, которое при охлаждении и высушивании исчезает.

5.4.6.2. ДЕЙСТВИЕ ЩЕЛОЧИ

Ход работы

В пробирку помещают 0,2 г роговых стружек или волоса, заливают 10-%-ным раствором едкой щелочи. При нагревании происходит частичный гидролиз кератина, в результате чего стружки растворяются и в растворе можно обнаружить аминокислоты.

5.4.6.3. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА АМИНОКИСЛОТЫ В СОСТАВЕ

КЕРАТИНА

Ход работы

А) 2 мл щелочного раствора кератина помещают в пробирку, добавляют 0,5 мл раствора уксуснокислого свинца, нагревают; появляется резко положительная реакция, свидетельствующая о том, что в кератине много аминокислот, содержащих серу;

Б) при нагревании роговых стружек с крепкой азотной кислотой появляется желтое окрашивание; это указывает на наличии в кератине аминокислот с бензольным ядром;

В) при нагревании с реактивом Миллона роговые стружки приобретают красноватое окрашивание, что указывает на содержание в кератине тирозина.

Контрольные вопросы

1. Общая характеристика метода хроматографии и ее роль в биохимии.

2. Назовите основные виды хроматографии.

3. Общая характеристика принципа хроматографии.

4. Назовите разновидности метода хроматографии на бумаге и чем они отличаются.

5. Как рассчитывается коэффициент подвижности (R_f) и что он характеризует?

6. Что такое «идентификация аминокислот» и как её проводят.

7. Способы гомогенизации биологического материала.

8. Методы определения гомогенности белковых препаратов.

9. Методы гидролиза белков.

10. Как осуществляется экстракция белков?

11. Методы фракционирования белков.

12. Методы очистки белков.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6.

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ БЕЛКОВ

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить некоторые физические свойства белков различного происхождения.

Теоретические основы занятия

Белки образуют коллоидные растворы, которые имеют следующие характеристики: низкое осмотическое давление, высокая вязкость, низкая способность к диффузии и др.

6.1. Исследование свойств желатина

При определенных условиях белковые растворы превращаются в гели. В гелях растворитель и белок образуют одну внешне гомогенную массу, подобную студню. Высушенный гель, помещенный в воду, впитывает ее в очень больших количествах. Это впитывание воды называется набуханием геля. Процессы набухания белков играют важную роль в пищевой промышленности.

6.1.1. Определение изоэлектрической точки желатина по минимуму набухания

Изоэлектрической точкой белка называется определенная величина рH среды, при которой белок находится в виде нейтральных молекул (в изоэлектрическом состоянии), несущих равные количества положительных и отрицательных зарядов. При других концентрациях ионов водорода в растворе имеют преимущественно положительные или отрицательные на белка.

Образование студней при добавлении желатина к различным изделиям - это процесс связанный с набуханием белков. Явление, обратное набуханию, т.е. выделение воды из геля, называется синерезисом.

Ход работы

В три пробирки вносят по 0,2 г порошка желатина и добавляют по 1 мл буферных растворов с рН = 2,0; 4,7; 9,0. Осторожно встряхивают и оставляют стоять на 1 ч. Определяют высоту геля в пробирках. Зарисовывают результаты и делают выводы о значении ИЭТ по минимуму набухания.

6.1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ ЖЕЛАТИНА ПО МУТНОСТИ (ПО КОАГУЛЯЦИИ)

Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы и легко выпадают в осадок. Для большинства белков изоэлектрическая точка близка к нейтральной среде, но не вполне совпадает с ней; для многих белков она сдвинута в кислую сторону, а некоторые белки имеют изоэлектрическую точку при слабощелочной реакции среды.

Ход работы

В три пробирки наливают по 0,5 мл буферных растворов с рН = 3,7; 4,7; 5,7 и по 0,5 мл 0,5% раствора желатина. Коагуляция желатина не наблюдается, так как желатин гидрофильный белок, обладающий двумя факторами устойчивости: зарядом и водной оболочкой. Затем во все пробирки приливают по 1 мл этилового спирта. В одной из пробирок раствор мутнеет. Объяснить результат.

6.1.3. ВЛИЯНИЕ РАСТВОРИТЕЛЯ НА НАБУХАНИЕ БЕЛКОВ

По растворимости белки делят на водорастворимые, спирторастворимые, солерастворимые и т.д. Водорастворимые, живущие в воде глобулярные белки наименее регулярны (особенно небольшие); их структура держится взаимодействиями белковой цепи с самой собой, причем особенно важны взаимодействия далеких по цепи, но сблизившихся в пространстве углеводородных (гидрофобных - "боящихся воды") групп, а также взаимодействиями белковой цепи с кофакторами. Наконец, небольшие или бедные углеводородными группами полипептиды могут сами по себе не иметь фиксированной структуры, но приобретать ее при взаимодействии с другими макромолекулами.

Ход работы

Кусочек каучука и небольшое количество желатина помещают в две пробирки с водой и в две пробирки с толуолом. Оставляют на 1 ч. Через час отмечают, в какой жидкости произошло набухание. Сделать вывод.

6.1.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТВОРОВ

На устойчивость белковых растворов влияет ряд факторов. В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее величину не влияет концентрация белка.

Ход работы

В две пробирки наливают по 1 мл золя гидроокиси железа, в первую пробирку добавляют 1 мл 0,5 % раствора желатина, во вторую 1 мл дистиллированной воды. Пробирки встряхнуть, в каждую пробирку добавить по каплям раствор сернокислого аммония до появления мути. Записывают число капель, добавленных в первую и вторую пробирки; сделать вывод.

6.2. ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ КАЗЕИНА

Фосфопротеин казеиноген в молоке находится в виде растворенной кальциевой соли, то есть в виде анионов. Свободный казеиноген в форме электронейтральных молекул характеризуется малой стабильностью в растворе.

6.2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИРОСВЯЗЫВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ КАЗЕИНА

Метод основан на гравиметрическом определении количества жира, удерживаемого белком в результате равновесного набухания абсорбента (белка).

Ход работы

К навеске изучаемого 0,5 г изучаемого белка добавляют 3 мл рафинированного подсолнечного масла, настаивают в течение 30 мин при слабом перемешивании. Смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин, сливают жидкость с осадка, осадок взвешивают. Жиросвязывающую способность определяют по разности массы осадка после центрифугирования и массы взятой навески: G = M₁/M₂∙100

где М₁ – масса абсорбированного жира, г М₂ – масса навески, г