Контрольные вопросы

1.Назовите основные факторы, обуславливающие стабильность молекул белка в растворе.

2. Причины осаждения белков нагреванием при рН около 7,0?

3. Характеристика обратимых и необратимых реакций осаждения белков.

4. Почему в растворе при рН<7,0 белки при нагревании не выпадают в осадок?

5. Почему в растворе при рН>7,0 белки при нагревании не выпадают в осадок?

6. Почему в растворе при рН<7,0 с добавлением хлорида натрия белки при нагревании выпадают в осадок?

7. Механизм действия минеральных кислот на молекулы белков в растворе.

8. Механизм осаждения белков органическими кислотами.

9. Механизм осаждения белков солями тяжелых металлов.

10. Механизм осаждения белков органическими растворителями.

11. Ренатурация белков, всегда ли она возможна?

Лабораторная работа № 5. Выделение, очистка и исследование состава белка из биологических объектов

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить способы выделения, очистки и химического исследования белков. Научиться выделять белки из различных легко доступных природных продуктов

Теоретические основы занятия

Процесс выделения белков включает следующие операции:

• измельчение биологического материала до однородной (гомогенной) массы (растения, органы и ткани животных, микроорганизмы);

• перевод белков в растворенное состояние (наиболее часто извлечение белков производят при одновременном измельчении биологического объекта);

• осаждение из раствора отдельных фракций (групп) белков;

• выделение индивидуального белка из смеси других белков.

Разделение белков проводят методами гельфильтрации (по размеру молекул), ионообменной хроматографии (на основе различий в общем заряде), электрофореза (по скорости миграции молекул в электрическом поле), аффинной хроматографии (на основе характерного для многих белков высокого сродства к специфическим химическим группам).

Отделение белков от низкомолекулярных веществ проводят путем диализа или ультрафильтрации через полупроницаемую мембрану.

Указания по технике безопасности

1. Хроматографию аминокислот проводить в вытяжном шкафу.

2. С нингидриновым раствором обращаться с осторожностью (окрашивает кожу).

3. Перед включением сушильного шкафа проверить заземление.

5.1. Высаливание белков

Высаливанием белков называется выделение белков из водных растворов нейтральными растворами концентрированных солей щелочных и щелочноземельных металлов. При добавлении достаточно больших концентраций этих солей к раствору белка происходит дегидратация белковых частиц и снятие заряда, при этом белок выпадает в осадок. Разные белки осаждаются при различных концентрациях солей, что зависит от ионной силы осадителя и размера частиц белковой молекулы. Например, глобулин, имеющий большой молекулярный вес, по сравнению с альбумином, легче выпадает в осадок, чем альбумин.

5.1.1. Высаливание белков сернокислым аммонием Ход работы

В пробирку наливают 20 капель неразведенного яичного белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сернокислого аммония, при котором выпадает осадок глобулинов. Через 5 минут осадок отфильтровывают. В фильтрате остается другой белок альбумин. К фильтрату добавляют измельченный порошок сернокислого аммония до полного насыщения. Выпавший осадок отфильтровывается. Фильтрат проверяют на полноту осаждения, проделав биуретовую реакцию. Для этого к фильтрату добавляют несколько капель 10% едкого натра и 1% раствора сернокислой меди. Если прошло неполное высаливание белков, фильтрат приобретает сине-фиолетовое окрашивание, что свидетельствует о наличии белка.