3.5. Кислотный гидролиз белка и формоловое титрование по серенсену

Гидролиз, проводимый в лабораторных условиях, является важным методом изучения первичной структуры белка. В организме гидролиз постоянно протекает в процессе пищеварения и в тканях под действием протеолитических ферментов. Гидролизаты белков (ферментативные или кислотные с добавлением триптофана) применяются в качестве лечебных препаратов для парентерального питания.

3.5.1. Кислотный гидролиз белка

При кислотном гидролизе белки распадаются на высокомолекулярные пептиды, низкомолекулярные пептиды, дипептиды и аминокислоты. Полный гидролиз белка протекает при многочасовом кипячении раствора в круглодонной колбе с воздушным холодильником в присутствии концентрированной серной кислоты.

Ход работы

В небольшую колбочку, снабженную обратным холодильником, наливают 3-5 мл 2% раствора альбумина и 10 мл 25% раствора серной кислоты. Содержимое колбы кипятят под тягой в течение 60-80 минут. Через каждые 15-20 минут (с момента закипания) с частью гидролизата проделывают биуретовую реакцию, для этого к 0,5 мл гидролизата добавляют 30% раствор щелочи до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге и 1-2 капли 1% раствора сульфата меди. Отрицательная биуретовая реакция указывает на полное расщепление белка до аминокислот. Написать уравнение гидролиза белков.

3.5.2. Формоловое титрование

Служит для определения количества карбоксильных групп, которое увеличивается вследствие разрыва пептидных связей в процессе гидролиза. Поскольку в водных растворах аминокислоты образуют внутримолекулярные соли без предварительного блокирования аминогрупп формальдегидом, непосредственно титровать карбоксильные группы аминокислот щелочью невозможно.

В процессе реакции формальдегид блокирует -аминогруппу:

Образующееся метиленовое соединение (метилен-аминокислота) оттитровывается щелочью с образованием соли.

Определяя количество карбоксильных групп титрованием, одновременно можно судить и о содержании аминных групп, так как количество титруемых карбоксильных групп эквивалентно количеству связанных формальдегидом аминных групп.

Метод формолового титрования позволяет следить за ходом гидролиза белка и изучить действие протеолитических ферментов. При полном гидролизе белка количество аминных и карбоксильных групп в гидролизате перестает увеличиваться и биуретовая реакция становится отрицательной.

Ход работы

3.5.2.1. ТИТРОВАНИЕ КАРБОКСИЛЬНЫХ ГРУПП В РАСТВОРЕ БЕЛКА ДО ГИДРОЛИЗА

Отмеривают в колбочку l мл раствора яичного белка, приливают 5 капель 20 % нейтрального раствора формалина и 3 капли 0,5 % раствора фенолфталеина. Титруют из микробюретки 0,005 н раствором едкого натра до устойчивой бледно-розовой окраски.

3.5.2.2. ТИТРОВАНИЕ КАРБОКСИЛЬНЫХ ГРУПП

ПОСЛЕ ГИДРОЛИЗА БЕЛКА (В ГИДРОЛИЗАТЕ)

Отмеривают в колбочку 1,25 мл гидролизата, добавляют 3 капли раствора фенолфталеина и нейтрализуют 10 % раствором едкого натра пипеткой до слабо-розовой окраски (щелочь используется для нейтрализации хлористоводородной кислоты, поэтому количество щелочи не учитывается).

Если при нейтрализации окраска делается ярко-красной (много NaОН), то добавляют до обесцвечивания по каплям 1 % раствор уксусной кислоты, избыток которой нейтрализуют 1 % раствором едкого натра до слабо-розовой окраски. Затем приливают 5 капель нейтрального 20 % раствора формалина. Вследствие блокирования аминогрупп формальдегидом и освобождения карбоксильных групп раствор приобретает кислую реакцию и фенолфталеин обесцвечивается. Обесцвеченный раствор титруют 0,005 н раствором NaOH до бледно-розового цвета и точно отмечают количество затраченной щелочи. Результаты титрования заносят в таблицу. Производят расчет азота аминогрупп по количеству затраченной щелочи, исходя из ее нормальности.

Массовую концентрацию аминокислот (мг/мл) рассчитывают по формуле:

,

где А и В – объемы раствора гидроксида калия, затраченные на титрование пробы и контроля, соответственно; f – коэффициент поправки на титр 0,05 моль/л раствора гидроксида калия; Q – масса аминокислот, эквивалентная 1 мл 0,05 моль/л раствора гидроксида калия (0,7 мл); V – объем раствора, взятый для анализа.

Нормальному раствору щелочи соответствует 14 г азота в 1 л или 14 мг в 1 мл, 1 мл 0,005 н раствора соответствует 0,07 мг азота.