2.1. Биуретовая реакция (реакция пиотровского)

В сильно щелочном растворе при добавлении соли меди такие вещества, как биурет (Н₂N-CO-NH-СО-NH₂), оксамид (H₂N-СО-СО-NH₂), полипептиды и белки образуют окрашенные в сине-фиолетовый и красновато-фиолетовый цвет комплексные соли. Белки дают сине-фиолетовое окрашивание; продукты их гидролиза (поли- и олигопептиды) – красную или розовую окраску. Биуретовая реакция обусловлена присутствием в молекуле или двух —CO—NH-групп или одной —CO—NH-группы или —CH₂—NH- групп, связанных непосредственно между собой или посредством атома углерода или азота.

Поэтому, биуретовую реакцию дают пептиды, содержащие, по крайней мере, три остатка аминокислот.

2.1.1. Обнаружение наличия пептидных связей в белках Ход работы

А. Берут пять пробирок и вносят по 1 мл : в первую воды, во вторую – раствора казеина, в третью – раствора яичного белка, в четвертую – раствора желатины, в пятую – раствора α-аминокислоты. В каждую пробирку добавляют по 2 мл раствора гидроксида натрия 10 % и по 3-4 капель раствора с массовой долей сульфата меди 1 %. Содержимое каждой пробирки перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 10 минут для развития окраски. При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить путем наслоения на раствор белка в щелочи 1 мл раствора с массовой долей сульфата меди 1 %.

Б. При малом содержании белка и недостаточной яркости и отчетливости получаемой окраски снова смешивают в чистой пробирке растворы белка и щелочи, наклоняют пробирку и осторожно приливают по ее стенке из пипетки 0,5-1 мл раствора сернокислой меди так, чтобы он образовал в пробирке верхний слой, не смешиваясь с остальной жидкостью. В этом случае на границе слоев появляется очень отчетливое фиолетовое прозрачное кольцо.

Результаты всех реакций вносят в табл. 1.

Таблица 1 - Биуретовая реакция на белки и аминокислоты

Исследуемый материал	Окраска продукта	Реагирующая группа
Вода
Казеин
Яичный белок
Желатин
Аминокислота

2.1.2. Обнаружение наличия пептидных связей в молекуле грамицидина

Содержимое одной таблетки с грамицидином растирают и вносят в пробирку, прибавляют тройной объем 30%-ного раствора гидроксида натрия и хорошо перемешивают. Затем из капельницы добавляют нескольку капель 1%-ного раствора сульфата меди и снова хорошо перемешивают. Развиваетя интенсивное сине-фиолетовое окрашивание, свидетельствующее о наличии пептидных связей в молекуле грамицидина.

2.2. НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ (РЕАКЦИЯ РУЭМАННА)

При нагревании растворов белков и полипептидов с нингидрином образуется синее окрашивание. Эта реакция обусловлена присутствием -аминокислот со свободной -аминогруппой, которые реагируют с нингидрином, причем обязуются альдегид, аммиак, СО₂ и восстановленный нингидрин. Восстановленная форма нингидрина реагирует с избытком нингидрина и с аммиаком. При этом образуется продукт конденсации сине-фиолетового цвета:

Окраска чувствительна к [Н⁺], поэтому нингидриновую реакцию ведут в нейтральном растворе. Кроме того, следует иметь в виду, что аммиак и -аланин также дают положительную нингидриновую реакцию. Чувствительность нингидриновой реакции может быть повышена добавлением аскорбиновой кислоты.