ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МУРМАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Кафедра микробиологии и биохимии

Методические указания

к выполнению практических работ

По дисциплине: Молекулярная биология

для направлений 020200.62 и 020400.62 «Биология»; профилей «Микробиология», «Биохимия», «Биоэколония», «Экология», «Общая биология»

Форма обучения: очная, очно-заочная

Мурманск

2013

Составитель – Елена Викторовна Макаревич, канд. биолог. наук, доцент, заведующая кафедрой микробиологии и биохимиии Мурманского государственного технического университета

Методические указания к выполнению контрольных работ рассмотрены и одобрены на заседании кафедры-разработчика «____»_________________2013 г., протокол № _____.

Рецензент – Ольга Юрьевна Богданова, канд. биол. наук, профессор кафедры микробиологии и биохимии Мурманского государственного технического университета

Оглавление

Модуль 1. ОБЪЕКТЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БИОМОЛЕКУЛ

1. Практическая работа № 1 БЕЛКИ.

Практическая работа № 1

СТРОЕНИЕ БЕЛКОВ

Теоретические сведения

● Белки — это природные высокомолекулярные соединения (биополимеры), структурную основу которых составляют полипептидные цепи, построенные из остатков α- аминокислот.

Пептидная

группа

┌-------- ┐

¦ O H ¦

¦ | | | ¦

H₂N─HC-¦-C—N-¦-CH—COOH

| ¦ ¦ |

R ¦ ↑ ¦ R

пептидная

связь

Каждую аминокислоту, входящую в состав белка, называют аминокислотным остатком. Аминокислотные остатки в молекуле белка соединены пептидными связями. Длина пептидной связи составляет 0,1325 нм, представляя собой среднюю величину между длинами одинарной С—N связи (0,146 нм) и двойной С = N связи (0,127 нм), т. е. пептидная связь частично имеет характер двойной связи (Рис.1.).

Рис.1 Пептидная связь

Полипептидная цепь состоит из регулярно повторяющихся участков, образующих остов молекулы, и вариабельных участков — боковых радикалов аминокислотных остатков. Полипептидная цепь имеет определенное направление, поскольку каждый из ее строительных блоков имеет разные концы: амино- и карбоксильную группы. Началом полипептидной цепи считают конец, несущий свободную аминогруппу (N-конец), а заканчивается полипептидная цепь свободной карбоксильной группой (С-конец). Эти свойства пептидной группировки определяют структуру полипептидной цепи, фрагмент которой представлен ниже:

H₂N- СН - СО - (NН - СН - СО) _n - NН - СН - СООН

│ │ │

R R R

(N-конец) (С-конец)

Именно радикалами и различаются аминокислотные остатки (табл. 1).

Таблица 1.

Протеиногенные аминокислоты

Формула	Название	Сокращенное обозначение
H2N-CH2-COOH	Глицин	гли
Н3С-СН-СООН │ NH2	Алании	ала
Н3С \ СН-СН-СООН Н3С ⁄ │ NH2	Валин	вал
Н3С \ СН-СН2-СН-СООН Н3С ⁄ │ NH2	Лейцин	лей
Н3С-СН2-СН-СН-СООН │ │ СН3 NH2	Изолейцин	иле
НООС-СН2-СН-СООН │ NH2	Аспарагино-вая кислота	асп
O=С-СН2-СН-СООH ⁄ │ NH2 NH2	Аспарагин	асн
НООС-СН2-СН2-СН-СООН │ NH2	Глутаминовая кислота	глу
O=С-СН2- СН2-СН-СООH ⁄ │ NH2 NH2	Глутамин	глн
HO-C6H4-CH2-CH-COOH │ NH2	Тирозин	тир
НО-СН2-СН-СООН │ NH2	Серин	сер
Н3С-СН-СН-СООН │ │ ОН NH2	Треонин	тре
HS-CH2-CH-COOH │ NH2	Цистеин	цис
Н3С-S-CH2-CH2-CH-COOH │ NH2	Метионин	мет
H2N-C-CH2-CH2-CH3-CH-COOH II │ NH NH2	Аргинин	арг
H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH-COOH │ NH2	Лизин	лиз
N — C-CH2-CH-COOH ║ ║ │ HC CH NH2 \ ⁄ N │ H	Гистидин	гис
HN ─ CH-COOH │ │ CH2 CH2 \ ⁄ CH2	Пролин	про
C6H5-CH2-CH-COOH │ NH2	Фенилаланин	фен

В остове пептидной цепи чередуются три типа связи. Вокруг одной из них (пептидной связи -CO—NH-) вращения невозможны. Зато вокруг двух остальных связей (-NH-CαH- и -CαH-CO-) возможно вращение. Это-то и позволяет пептидной цепи изгибаться самым причудливым образом, что приводит к образованию вторичной и третичной структур.

Вторичная структура

Вначале многие фрагменты пептидной цепи приобретают периодическую укладку того или иного типа: a-спираль, β-структуру (рис. 2-5) или коллагеновую спираль. Этот низший уровень пространственной организации называется вторичной структурой.

Рис. 2. типы вторичной структуры белка

a-Спиралъ. Здесь остов пептидной цепи закручивается в спираль — так, что радикалы аминокислот обращены кнаружи от спирали.

Рис. 3. α-спираль

-

Эта структура удерживается водородными связями между остовами аминокислот. Более точно, в образовании одной такой связи участвуют группа —NH— одной аминокислоты и группа —CO— другой аминокислоты, которая в пептидной цепи отделена от первой тремя другими аминокислотами.

В итоге на один виток а-спирали приходится в среднем 3,6 аминокислотных остатков

β-Складчатая структура. Здесь остовы пептидных цепей не скручены в спираль, а имеют зигзагообразную конфигурацию (структура складчатого листа).

Такая структура тоже удерживается водородными связями и между теми же группами (—NH— и —CO—). Ho теперь (если речь идет о глобулярном белке) для сближения этих групп и об разования связей пептидная цепь образует складки.

Рис. 4. β-складчатая структура

Т. е. имеется двойная складчатость:

- во-первых, крупные складки в результате поворота цепи на 180°,

- во-вторых, мелкие изгибы цепи в пределах одной складки.

Прилежащие друг к другу участки цепи в -структуре могут быть как параллельными (идти в одном направлении), так и антипараллельными.

Коллагеновая спираль. Молекула коллагена представляет собой правозакрученную спираль из трёх цепей. Один виток спирали содержит три аминокислотных остатка.

Все три спирали оплетают друг друга, образуя правозакрученную суперспираль; таким образом, окончательная структура представляет собою жгутоподобный стержень.

Наличие глицина в каждом третьем положении повторяющейся последовательности -Gly-X-Y-является существенным, поскольку большая по размеру аминокислота не сможет стоять в центре тройной спирали, в месте схождения трех полипептидных цепей. Пролин часто присутствует в положении "X" последовательности -Gly-X-Y-, а гидроксипролин - в положении "Y".

Рис. 5. Коллагеновая структура

Указанные аминокислотные остатки ограничивают вращение полипептидной спирали. Тройная спираль стабилизируется водородными связями и водными мостиками. Тройная спираль представляет собою относительно жесткую структуру. В некоторых случаях сопротивление молекулы растяжению или сжатию является важным для осуществления биологической функции белка. Во многих коллагенах тройная спираль прерывается глобулярными последовательностями, придающими белку большую гибкость.

В одной и той же молекуле глобулярного белка могут встречаться разные виды вторичной структуры, а также и бесструктурные участки (лишенные какой либо вторичной структуры). Соотношение между ними в разных белках различно.

Вторичная определяется первичной структурой белка или рассматриваемого фрагмента. Иными словами, боковые радикалы аминокислот, хотя непосредственно и не участвуют в стабилизирующих эту структуру связях, тем не менее определяют, каким образом пептидная цепь может свернуться для образования таких связей и может ли свернуться вообще.

Так, например, остатки пролина гидроксипролина полностью исключают образование в своем локусе как а-спирали, так и β-структуры.

Отсюда и получается типичное для каждого белка распределение между разными типами вторичной структуры

Третичная структура

О третичной структуре обычно говорят применительно лишь к глобулярным белкам.

Под ней понимают конформацию белковой глобулы, т. е. укладку в пространстве а-спиральных, β-структурных и бесструктурных участков пептидной цепи.

В отличие от вторичной, третичная структура образуется и удерживается за счет образования связей непосредственно между радикалами аминокислот.

Конкретный характер этих связей зависит от природы радикалов (табл. 2).

Таблица 2

Типы радикалов аминокислот и образуемые ими связи

Типы радикалов	Соответствующие аминокислоты	Примерное содержание в белках	Связи, образуемые радикалами
Неполярные радикалы	Гли, Ала, Вал, Лей, Иле, Мет, Фен, Три, Про	50%	Гидрофобные и ван-дер- ваальсовы взаимодействия
Полярные радикалы не способные к ионизации	Сер, Цис, Тир, Гип (гидроксипролин), Асн, Глн, Тре	20%	Водородные связи. Для Цис еще и дисуль-фидные связи
Полярные радикалы, способные к ионизации при физиологическом pH	Асп, Глу, Apг, Лиз, Гил (гидроксилизин), Гис	30 %	Ионные и водородные связи

Как видно из таблицы, по своим физико-химическим свойствам радикалы всех аминокислот подразделяются на 3 группы, а образуемые между ними связи сводятся к 4 -5 видам.

Среди последних одна связь является ковалентной — дисульфидная связь между остатками цистеина.

Остальные связи — нековалентные, т. е. относятся к слабым взаимодействиям. Это:

- ионные связи между разноименно заряженными (а следовательно, гидрофильными) радикалами,

- водородные связи между полярными (как заряженными, так и незаряженными) радикалами,

- гидрофобные и ван-дер-ваальсовы взаимодействия между неполярными (т. е. гидрофобными) радикалами.

Слабый характер ионных и водородных связей в значительной мере обусловлен влиянием водной среды, в которой обычно находится белок. Так, дипольные молекулы воды, ориентируясь вокруг полярных (в т. ч. заряженных) радикалов, в 80 раз снижают электрическое поле заряженных

радикалов и могут сами образовывать водородные связи с полярными радикалами. На разрушение этих связей расходуется большая часть энергии межрадикального взаимодействия.

Тем не менее, замыкание большого числа межрадикальных связей приводит к образованию термодинамически наиболее устойчивой конфигурации — нативной третичной структуры белка (рис. 6).

Рис. 6. Типы расположения вторичной структуры в глобулах

При этом взаимодействующие друг с другом радикалы могут находиться в вытянутой пептидной цепи весьма далеко друг от друга. Сближение же их происходит лишь в результате сложных изгибов этой цепи в трехмерном пространстве.

В итоге образуется глобулярная частица, причем одни радикалы находятся внутри нее, а другие на ее поверхности. Основная часть гидрофобных радикалов находится внутри глобул, а большинство гидрофильных радикалов на поверхности (рис.7).

Рис. 7. Расположение радикалов в глобуле

Это правило не является абсолютным, некоторое количество гидрофобных радикалов остается на поверхности. Данный факт имеет значение при связывании белка с лигандом, имеющим гидрофобный радикал.

На уровне третичной структуры белок приобретает характерные функциональные свойства, в нем формируются активные центры.

В то же время третичная структура имеет некоторую подвижность. На конформацию белка могут влиять температур, химическая модификация белка, специфические вещества и пр. Изменение конформации белка – важнейший способ изменения их физиологической активности, который широко используется в клетке для регуляции различных процессов.

Четвертичная структура

О наличии у белка четвертичной структуры говорят тогда, когда он состоит из нескольких субъединиц. Примером является гемоглобин, молекула которого включает 4 субъединицы двух видов (рис 8).

Рис. 8. Гемоглобин

Субъединицы связываются за счет взаимодействия аминокислотных радикалов, находящихся на контактирующих поверхностях субъединиц. Эти поверхности по расположению данных радикалов являются взаимно комплементарными. В частности, они нередко обогащены гидрофобными и разноименно заряженными радикалами.

Таким образом, связывание субъединиц может происходить лишь после образования третичной структуры.

С другой стороны, это связывание само сказывается на третичной структуре субъединиц: доводит ее до функционально активного или, напротив, неактивного состояния. Поэтому такие белки обычно активны лишь в олигомерной форме (как гемоглобин) или, наоборот, только в диссоциированном состоянии (как некоторые протеинкиназы).

В последнем случае одни субъединицы служат для подавления активности других и диссоциируют под влиянием специального сигнала (циклического АМФ).

ВАРИАНТ 1

ЗАДАНИЕ 1

Пользуясь таблицей 1, запишите по четыре примера формул полипептидов, содержащих в своем составе радикалы аминокислот:

- гидрофобные ароматические;

ЗАДАНИЕ 2

Напишите примеры структурных формул возможных октапептидов, в состав которых входят:

аланин, глутамин и тирозин;

ЗАДАНИЕ 3

Напишите примеры структурных формул тетрапептидов на N-конце которых находится:

диаминомонокарбоновая аминокислота;

ЗАДАНИЕ 4

Укажите типы взаимодействий между боковыми радикалами аминокислотных остатков и изобразите их графически: тир и глу;

Задание 5

Решите тесты

1.Установите соответствие. Подберите к каждой аминокислоте соответствующее название.

A. Apг Б. Асп В. Вал Г.Лиз Д. Фен

1 H2N—CH—СООН (СН2)4 NH2 2. H2N—CH —COOH СН2 СООН 3. H2N—CH- СООН

2. Установите соответствие. Подберите к каждой аминокислоте соответствующее свойство радикала.

A.. Фен 1. Гидрофильный с анионной группой Б. Глу 2. Гидрофильный с катионной группой

B. Цис 3. Гидрофобный

Г. Apг Д. Сер

3. Выберите один правильный ответ. Пептид, на С-конце которого находится иминокислота:

A. Вал — Иле — Сер — Тре Б. Цис - Ала — Про — Тир

B. Про — Гис — Гли — Три Г. Мет - Глу — Лиз - Фен Д. Иле — Три — Сер — Про

4. Выберите один правильный ответ. Пептид, на N-конце которого находится диаминомонокарбоновая кислота:

A. Тре — Ала—- Лиз — Про Б. Лиз — Сер — Гис — Глн

B. Асн — Вал — Иле - Apr Г. Глу — Лей — Тре — Лиз Д. Три — Мет — Гли — Глн

5. Выберите один неправильный ответ. Радикалы аминокислот могут образовывать водородные связи:

A.Тре Б. Apг

B.Гис Г. Три

Д. Асп

6. Установите соответствие.

A. Первичная структура Б. Вторичная структура B. Третичная структура Д. Четвертичная структура

Порядок чередования аминокислот, соединенных пептидной связью Пространственная структура, образованная водород­ными связями, возникающими между атомами пептидного остова

7. Установите соответствие. Подберите к пронумерованным типам связей их графическое изображение:

А. — СН3 Б. -CH-CO-NH-CH- R1 R2 В. NH О=С Г. NH3+ - ООС— Д. -ОН - ООС—

1. Водородная связь, участвующая в формировании вто­ричной структуры 2. Водородная связь, участвующая в формировании третичной структуры 3. Гидрофобное взаимодействие