3.3. Види трансгенних тварин
Трансгенні корови.Якщо передбачається використовувати молочну залозу як біореактор, то придатною твариною для трансгенозу є велика рогата худоба, яка щорічно дає до 10 000 л молока, в якому міститься до 35 г білка на 1 л. Якщо в молоці буде міститися така кількість рекомбінантного білка й ефективність його очищення становитиме 50%, то від 20 трансгенних корів можна буде отримувати приблизно 100 кг такого білка за рік. За випадковим збігом, саме стільки білка С, що використовується для запобігання тромбоутворення, потрібно щорічно. З іншого боку, однієї трансгенної корови буде цілком достатньо для одержання необхідної щорічно кількості фактора IX (фактора Кристмаса) каскадного механізму згортання крові, що вводять хворим на гемофілію для підвищення її зсідання.
Для створення трансгенних корів використовують модифіковану схему трансгенозу мишей методом мікроін'єкцій ДНК. Процедура включає такі основні етапи:
збирання ооцитів корів, забитих на скотобійні;
дозрівання ооцитів іп virto;
запліднення спермою бугаїв іп virto;
центрифугування яйцеклітин, що запліднені, для концентрування жовтка, який в нормальних яйцеклітинах запобігає баченню чоловічого пронуклеусу за допомогою мікроскопу;
мікроін'єкція ДНК в чоловічий пронуклеус;
розвиток ембріона іп virto;
нехірургічна імплантація одного ембріона самки-реципієнту під час тічки;
скринінг ДНК нащадків на наявність трансгена.
У тестових експериментах із пула в 2470 ооцитів було отримано два трансгенних теляти. Дослідження в цій галузі тривають, і є надія на вдосконалення методики трансгенозу. Один зі способів полягає в тому, що відбирають незначну кількість клітин з ембріона, що розвивається іп virto, і тестують їх на наявність трансгена; така втрата клітин ембріоном не перешкодить його нормальному розвитку. Цей тест дозволить імплантувати лише ембріони, що несуть трансген.
Трансгенні вівці, кози й свині. Досліди із трансгенозу на вівцях і козах, в основному, спрямовані на перетворення молочних залоз цихтварин у своєрідні біореактори для одержання білкових продуктів, що використовуються в медицині. Незважаючи на те, що надої овець і кіз менші ніж у корів, за рік вони дають сотні літрів молока. За допомогою методу, аналогічного використаному для створення трансгенних мишей у трансгенних конструкцій, що містять гени людини під контролем промоторів, специфічних для молочних залоз, було створено трансгенну вівцю і козу, в молоко яких секретирували білки людини. Вони були глікозиліровані й мали активність, близьку до тих відповідних білків, що одержані від людини. Експресія трансгенів у клітинах молочних залоз овець і кіз не виявляла ніяких побічних дій ні на самок у період лактації, ні на нащадків, що вигодовуються. На відміну від цього, за введення свиням трансгена гормону росту бугаїв під контролем промотору металотіонеїну спостерігалися несприятливі ефекти. Кількість гормону в різних особин у групі трансгенних свиней розрізнялася, однак у цілому вся ця група швидше збільшувала вагу. На жаль, цей позитивний результат частково знецінювався різними паталогіями: у тварин виявляли виразку шлунку, ниркову недостатність, кульгавість, запалення перикарду, зменшення рухливості суглобів, схильність до пневмонії. Причини цих симптомів невідомі. Можливо, вони пов'язані з довгостроковою присутністю в організмі надлишку гормону росту. У цих експериментах трансген синтезувався більш-менш безперервно. Було створено також трансгенну вівцю з підвищеною швидкістю росту вовни. Для цього кДНК овечого інсуліноподібного фактора росту було поміщено під контроль мишачий промотор гена кератину з високим вмістом сірки, що забезпечувало гіперекспресіюкДНК. При цьому в трансгенних овець, на відміну від свиней, ніяких небажаних побічних ефектів не спостерігалося.
Позитивні результати отримали й за експериментів із трансгенними свинями. Наприклад, були створені здорові трансгенні свині, у геномі яких присутня така генетична конструкція: регуляторна ділянка гена -глобіна людини, два гени 1-глобіна людини й один ген A-глобіна людини. У результаті її експресії в клітинах крові свиней синтезувався людський гемоглобін, при цьому, при заміні людського промотору гена -глобіна свинячим, людський гемоглобін синтезувався в значно більшій кількості. Людський гемоглобін, що продукується трансгенними свинями, мав такі ж хімічні властивості, як і природний людський. Його можна було очистити від гемоглобіну свиней звичайною хроматографією.
Ці результати вказують на принципову можливість заміни цільної крові, що використовується за трансфузії, людським гемоглобіном, отриманим методом трансгенозу. Однак, ізольований гемоглобін переносить кисень не так ефективно, як гемоглобін у складі еритроцитів. Більше того, він швидко руйнується в організмі тварини, куди був уведений, а продукти його розпаду токсичні для нирок. Таким чином, одержання замінника людської крові за допомогою трансгенозу − це справа майбутнього.
Трансгенна птиця.При створенні трансгенної птиці виникають певні проблеми, що пов'язані з особливостями відтворення і розвитку птиці. Так, за запліднення птиці в яйцеклітину можуть проникнути одразу декілька сперматозоїдів, а не однин, як це звичайно буває у ссавців, і визначити певний чоловічий пронуклеус, що з'єднується з жіночим, стає неможливим. Тобто, метод мікроін'єкції для створення трансгенної птиці непридатний. А якщо і вдасться здійснити мікроін'єкцію ДНК в ядро, наступні операції буде важко зробити, оскільки у птиці яйцеклітина після запліднення досить швидко вкривається міцною мембраною, шаром альбуміну і внутрішньою та зовнішньою вапняними оболонками. Використання ретровірусів як вектори неефективне через причини, указані раніше. Ніяких специфічних ЕS-клітин для птиці також не знайдено (рис. 37).
Більш перспективним є метод з використання рекомбінантних ембріональних клітин. Він полягає у тому, що відокремлюють клітини бластодерми з курячого ембріону, за допомогою катіонних ліпідів, що зв'язані з трансгенною ДНК, проводять трансфекцію, і знову вводять їх до підзародкової зони свіжовідкладених яєць. Частина нащадків буде нести у незначній кількості клітини донору. Таких тварин називають химерами. У деяких химер клітини, що створилися з трансформованих клітин, можуть становити лінії зародкових клітин, і після декількох раундів схрещування можна отримати лінії трансгенних тварин. Для збільшення ймовірності створення химер, що мають чужорідні гени в клітинах зародкової лінії, кількість донорських клітин у химерах можна підвищити за рахунок випромінювання ембріонів реципієнту перед введенням у них трансгена (540...660 рад протягом 1 години). Під впливом випромінювання деякі (але не всі) клітини бластодерми гинуть, і співвідношення між трансформованими клітинами і клітинами реципієнта збільшується на користь перших.
Трансгенні риби.У міру вичерпання природних рибних запасів усе більшого значення набуватиме розведення риби в штучних умовах. Основна мета досліджень у цій галузі − створення рекомбінантних риб шляхом трансгенозу. До цього часу транс гени вводять мікроін'єкцією ДНК або електропортацією запліднених яйцеклітин різних видів риб − форелі, лосося, коропа та ін. Трансгенну ДНК вводять в цитоплазму запліднених яйцеклітин або клітин ембріонів, що досягли стадії чотирьох бластомерів. Ембріогенез відбувається у риб у водному середовищі поза організмом, тому немає необхідності здійснювати імплантацію. Всі наступні процеси можуть відбуватися в резервуарах з температурою, що регулюється. Після мікроін'єкцій життєздатними залишаються від 35 до 80% ембріонів, а доля трансгенних нащадків коливається від 10 до 70%.
Більшість перших досліджень в цій галузі було спрямовано на визначення впливу трансгена гормону росту на швидкість росту. Як правило, трансгенні лососі були більш крупні і швидше набували вагу ніж контрольні особі. Для експресії було обрано систему з прискореною транскрипцією гена гормону росту в холодній воді, що була придатна для всіх риб, тобто використовувався ген гормону росту риб для запобігання біологічної несумісності. Однорічні трансгенні особі, що були отримані в результаті введення в яйцеклітини генетичної конструкції гормону росту, придатної для всіх риб, важили, приблизно, в 11 разів більше за нетрансгенних. Передбачається, що у наступному гени стійкості до хвороб і стресових впливів, а також гени, що обумовлюють інші біологічні особливості, будуть уведені як рибам помірних зон, так і тропічним рибам.
Нажаль, інтеграція трансгена, як правило, має випадковий характер:
у деяких випадках чужорідна ДНК стимулюєвиникненнямутацій;
не завжди трансгенна тварина характеризується експресією трансгена. Наприклад, експерименти щодо введення гена гормону росту людини сільськогосподарським тваринам дозволили отримати трансгенних кролів і свиней, однак ріст їх не відрізнявся від росту контрольних тварин;
експресія трансгена в організмі трансгенної тварини окрім позитивного ефекту, що очікується, може викликати і негативну реакцію. Збільшення рівня гормона росту в крові трансгенних овець у деяких випадках приводило до виникнення діабету і загибелі тварин;
внесення трансгена в ембріон може викликати народження мозаїків. Мозаїками вважаються тварини, які мають дві або декілька клітинних ліній, що походять з одної зиготи, але мають різні генотипи. Трансгенні мозаїки, крім клітинних ліній, що містять трансген, мають нетрансгенні лінії. За отриманні від таких тварин нащадків можуть виникнути певні труднощі. Так, якщо клітини гонад не містять трансген, нащадки не можуть успадковувати ін'єктований ген від трансгенних батьків. Дані, які маємо, свідчать, що близько 30% первинних трансгенів, отриманих за рахунок методу мікроін'єкцій, є мозаїками. Частина мозаїків зовсім не здатна створити трансгенну лінію, оскільки в них відсутня спадкова передача трансгена.