Використання сперматозоїдів як векторів трансгена

Як природний вектор, що доставляє ДНК до клітин, можуть бути використані сперматозоїди. Вже в 1971 році була показана можливість перенесення ДНК SV40 до яйцеклітин кролів після штучного запліднення спермою, що попередньо інкубувалася із ДНК.

У досвідах М. Лавітрано зі співавторами (1989) 30% мишей, отриманих після запліднення обробленої ДНК спермою, виявилися трансгенними й передавали трансген нащадкам. Наступні численні спроби в інших лабораторіях в усьому світі виявилися неуспішними. Аналіз 1300 мишей, що народилися після запліднення іп vitroобробленої ДНК спермою, не виявив наявності трансгена в жодної з досліджених особин. Дослідження показали, що за застосування методу перенесення ДНК за допомогою сперматозоїдів у одній і тій же лабораторії, навіть за використання однакової схеми досліджень, можуть бути отримані суперечливі результати. Це дозволяє припустити, що вбудовування ДНК відбувається тільки на певній стадії клітинного циклу. Однак дотепер не встановлений механізм інтеграції екзогенної ДНК у геном сперматозоїдів.

Досліджували, так само, здатність сперматозоїдів поглинати лінійну ДНК іп vitroі іп vivo. Наявність чужорідної ДНК було показано в 60...70% сперматозоїдів після обробкиіп vitroі іп vivo. Позитивний сигнал був виявлений у ядрі сперміїв і не зникав за обробки ДНКазою. Таким чином, було показано, що сперматозоїди як іп vitro, так і іп vivo здатні поглинати ДНК і акумулювати її в ядрі, а також те, що секрети придатків і сім'яних канальців не блокують цей процес.

Для підвищення ефективності зв'язування ДНК зі сперматозоїдами використовують різні методи: ДНК-ліпосомні комплекси, ін'єкцію в сім'яники, безпосередню ін'єкцію в сім'яні канальці й придатки, ін'єкцію в сім'яні канальці з наступною електропорацією, доін'єкцію головок сперміїв і ДНК в ооцити.

Використання сперматозоїдів як носіїв для трансгена здатне забезпечити інтродукцію їх у геном зародка в найбільш оптимальний для цього період. Однак, це залежить від місця, в яке потрапляє чужорідна ДНК. Установлено, що для бугаїв і кнурів здатність до зв'язування трансгена обмежена головним чином екваторіальною зоною і постакросомальним районом головки сперматозоїда. Потрапляння чужорідної ДНК в залишки цитоплазми в основі хвоста не призводить до трансгенозу.

Сперматозоїди мають спонтанну тенденцію до зв'язування трансгена, що присутній в культуральному середовищі. Експерименти показали, що з'єднання чужорідної ДНК і її проникнення в головку сперматозоїда можливе лише в тому разі, коли сім'яна плазма ретельно віддалена.

Нещодавні дослідження виявили, що перенесення трансгенів за допомогою сперматозоїдів у геном зиготи може здійснюватися не лише в умовах іп vitro, але і за запліднення іп vivo. В цих експериментах відмиті від сім'яної плазми сперматозоїди кнура утримували в культуральному середовищі з плазмідою, що містила трансген, протягом ЗО хвилин, після чого оброблені сперматозоїди центрифугували до об'єму 1 мл і вносили в кожен ріг матки за допомогою ін'єкції по 0,5 мл трансформованих сперміїв. Відсоток запліднення свиноматок склав 73 (16 свиноматок з 22), і 10 з 48 (21%) поросят виявилися трансгенними.

Використання сперматозоїдів як носіїв трансгена за запліднення іп vivoдуже спрощує технологію отримання трансгенних тварин і може дуже збільшити частоту інтеграції чужорідних генів.

Велику увагу останнім часом приділяють маніпуляції зі стовбуровими клітинами сім'яників − сперматогоніями. Було продемонстровано можливість переносення сперматогоніїв від одного самця іншому як у тварин одного виду (миша), так і між двома різними видами тварин (миша − пацюк). Крім того, була показана можливість успішного протікання сперматогенезу після пересадження кріоконсервованих клітин сім'яників мишей, а також після їх тривалого культивування (більше трьох місяців).

Успішне тривале культивування статевих клітин тварин іп vitroуможливлює проведення трансформації сперматогоніїв екзогенної ДНК із наступною селекцією. Нагано Р. зі співавторами (2000) повідомили про успішне введення екзогенної ДНК у сперматогонії іп vitroі іп vivoза допомогою ретровірусної системи доставки. Експресію ретровірусної генної конструкції, що включає lacZ, спостерігали в сім'яниках більше шести місяців. Аналіз показав, що принаймні 1 з 300 стовбурових клітин сім'яників містив трансген.

У поєднанні з пересадженням трансформованих статевих клітин у сім'яники реципієнтів і успішним протіканням сперматогенезу даний підхід може бути використаний для одержання трансгенних нащадків.

Найбільш важливі теоретичні та експериментальні досягнення світової науки у створенні генетично модифікованих тварин узагальнені у табл. 5.

		Таблиця 5
Досягнення у використанні трансгенних технологій
Рік	Подія		Автор
1971	Доставка чужорідної ДНК в ооцити кроля сперматозоїдами.		Вrаскеіtеt al
1985	Одержання трансгенних		Brem et al. Hammer et al
	сільськогосподарських тварин методом		Hammer et al.
	мікроін'єкції.
1986	Ембріональні химери з використанням ЕСК. Одержання овець за допомогою пересадки ядер.		Gоsslеret аl. Willadsen
1987	Одержання ВРХ методом пересадки ядер.		Рrаthеr еt аl.
1988	Одержання кролів методом пересадки ядер.		Stісе и Rоbl
1989	Одержання трансгенних мишей і свиней за допомогою сперміїв як векторів.		Lаvіtrапо еt аl.
	Одержання трансгенної ВРХ методом		Gandolfi et al.
	мікроін'єкції.		Schelander et al.
	Одержання свиней методом пересадки ядер.		Prather et al.
1995	Одержання трансгенної ВРХ за допомогою Зскеїапа'егеіаі.		Schelander et al.
	сперміїв.
1996	Одержання овець методом пересадки ядер		Сатрbеll еt аl.
	ембріональних клітин, що культивуються.
	Одержання ЕСК приматів.		Тhотsoп еtаl.
1997	Одержання овець методом пересадки ядер фетальних і соматичних клітин.		Wilтиt еt аl.
	Трансгенні вівці отримані методом пересадки ядер трансформованих клітин, що культивуються.		Sсhпіекеet аl.
	Химерні трансгенні свині із використанням ЕСК.		Рiеdrahitaеіtаl.
1998	Одержання трансгенної ВРХ за допомогою:		СіЬеlli еt аl.
	- пересадки ядер фетальних фібробластів;		Chan et al.
	- псевдотипнихретровірусних векторів;		Kato et al.
	- пересадки ядер диференційованих клітин.
2000	Одержання свиней методом пересадки ядер РоЩаечаеіаі.		Polejaeva et al.
	соматичних клітин (клітини гранульози)

Останнім часом, працюючи із тваринами, досліджують можливість застосування нового методу введення чужорідної ДНК у геном реципієнта − балістичної трансфекції, спочатку розробленого для генетичної трансформації рослинних клітин, сутність якого полягає у бомбардуванні клітин, які трансфікуються, швидколітаючими мікрочастинками важких металів (вольфрам, золото), що несуть на собі чДНК; проникаючи в ядро клітини, мікрочастинки переносять туди ген, що інтродукується.

У результаті проведених експериментів була продемонстрована експресія внесеного таким способом гена -галактозидази в ембріонах мишей, що розвиваються (2-клітинних, морулах, бластоцистах), при цьому експресія трансгена залежала від стадії розвитку трансфікованих ембріонів, тобто від імовірності його влучення в клітини-реципієнти, що перебувають в 8-фазі клітинного циклу. Крім того, на мишах і пацюках показана можливість балістичної інтродукції чужорідних генів у соматичні клітини (печінки, м'язів, шкіри) живого організму іп situ, що може бути використано для генної терапії й генетичної імунізації.

Трансфекція клітин за допомогою фосфату кальціює одним із методів введення рекомбінантних ДНК, що найбільш широко використовується, але важко відтворюються. Розчин C_aC1₂ поряд із ДНК, що в ньому міститься, повільно змішують із фосфатним буфером, внаслідок чого утворюється нерозчинний фосфат кальцію і одночасно відбувається осадження ДНК. Суспензія вноситься у чашки Петрі, де культивуються клітини. Через деякий час часточки фосфату кальцію, що містять ДНК, сорбуються на поверхні клітин і проникають усередину внаслідок ендоцитозу. У подальшому незначна фракція рекомбінантної ДНК з'являється в ядрі, де може бути інтегрованою до хромосоми або деякий час існувати у позахромосомному стані. Метод дуже простий у реалізації, однак дуже чутливий до умов здійснення експерименту (концентрації ДНК і C_aC1₂, значенням рН, тривалості трансфекції) і тому важко відтворюється. Надмірна тривалість інкубації клітин з фосфатом кальцію викликає його цитотоксичний вплив. З урахуванням цього, для кожної лінії клітин потрібне здійснення ретельної оптимізації умов.

Ліпосоми і трансфекція. Використання ліпосом є ще одним ефективним, популярним і універсальним методом уведення рекомбінантних ДНК до клітин тварин і людини. Для створення ліпосом найчастіше використовують катіонні ліпіди, що є амфіфільними (здатними приєднувати з обох боків) молекулами, якісамоасоціюються і у присутності ДНК, завдяки електростатичним та іншим взаємодіям, конденсуються у часточки, що дістали назву ліпотекси (Проріехез). Ліпоплекси, що несуть сумарний позитивний заряд, взаємодіють із сіаловими кислотами клітинних мембран і забезпечують ефективне проникнення ДНК усередину клітини в процесі ендоцитизу. Незважаючи на те, що більшість ДНК, яка потрапила у лізосоми, деградує, значна їх фракція доставляється в ядро клітин, що трансфекуються.

Для отримання ліпоплексів катіонні ліпіди і ДНК змішують у безсироватковому поживному середовищі, оскільки сироватка запобігає їх об'єднанню, і клітини, що культивуються, короткочасно інкубують в їх присутності. Метод дозволяє здійснювати як тимчасову, так і постійну трансфекцію з утворенням стабільних клітинних ліній. За допомогою ліпосом вдається здійснити трансфекцію у складних випадках тих клітинних ліній, які не піддаються введенню рекомбінантних ДНК іншими способами. Більш того, даний метод допускає проведення трансфекції у суспензійних культурах, не потребує мітотичного поділу клітин під час проведення експерименту і, як правило, високо відтворювальний.