Використання ретровірусних векторів
Одним із методів отримання трансгенних тварин (наприклад, мишей) є зараження передімплантованих ембріонів рекомбінантними ретровірусами. Геном ретровірусів відносно невеликий і з ним досить легко маніпулювати, вводячи до нього чужорідні гени; ретровіруси достатньо інфекційні по відношенню до клітин (майже 100% зараження), а єдина копія ретровірусного генома ДНК точно визначеним чином інтегрується із ДНК клітини-мішені. Клітини, в які потрапили поряд із вірусом чужорідні гени, здатні здійснювати їхекспресію. Рівень експресії клонованих генів значно підвищується внаслідок того, що ретровіруси містять досить активні транскрипційні енхансери (посилювачі). Відомі ретровірусні вектори походять від вірусів лейкозу мишей (МLV) або вірусів птиці (АLV).
Чужорідних днКу геном тварин
Кожна вірусна часточка містить дві копії одноланцюгового РНК-генома, а після проникнення у клітину цей геном під впливом ревертази перетворюється на лінійну дволанцюгову ДНК. Для інтеграції до генома клітини-мішені дволанцюгова лінійна ДНК віруса проникає до ядра, де набуває кільцевої форми. Інтегрована лінійна ДНК-копія ретровірусного генома (провірус) містить на обох кінцях довгі нуклеотидні повтори -LТR(від англ. Іопgtеrтіпlї rереts). До складу 5'LТRвходить промотор, з якого починається транскрипція генів інтегрованого провірусу; 3'LТR− сайт поліаденілірування, де здійснюється термінація РНК-транскриптів.
Існує ряд векторів на основі ретровірусного генома. У найпростіших випадках видаляють структурні гени і на їх місце вбудовують один або більше рестрикційних сайтів з метою клонування.
Для зараження рекомбінантним ретровірусом ембріональних клітин, у культуральну рідину із інфікованими фібробластами, що продукують рекомбінантний вірус, поміщають восьмиклітинну морулу, яка звільнена від оболонки. Морула інфікується і після досягнення стадії бластоцисти її вводять у матку псевдовагітної самки. Частина бластоцист може загинути, а частина нормально розвивається і у визначений час трансформується у трансгенних нащадків, які потім підлягають ретельному генетичному аналізу і можуть бути використані для створення трансгенних ліній (рис. 32).
Трансгенна тварина засновник
Рис. 32. Отримання трансгенних тварин за допомогою ретровірусів
Перевага методу, що заснований на використанні ретровірусних векторів, перед іншими методами трансгенозу полягає в його ефективності. Однак, розмір вставки в цьому разі обмежується 8 т.п.н., внаслідок чого трансген може виявитися позбавленим прилягаючих регуляторних послідовностей, необхідних для його експресії.
Використання ретровірусних векторів має ще один великий недолік. Хоча ці вектори створюються так, щоб вони були дефектними за реплікацією, геном штаму ретровірусу, що необхідний для одержання великої кількості векторної ДНК, може потрапити в те ж ядро, що й трансген. Незважаючи на всі вжиті заходи, ретровіруси можуть реплікуватися в організмі трансгенної тварини, що зовсім неприпустимо, якщо цих тварин передбачається використати в їжу або як інструмент для одержання комерційного продукту. І оскільки існують альтернативні методи трансгенозу, ретровірусні вектори рідко використовуються для створення трансгенних тварин, що мають комерційну цінність.