3.4.2. Одержання інтерферонів

Інтерферони −група білків, здатних продукуватися в ядерних клітинах хребетних. Ці потужні індуцибельні білки є фактором неспецифічної резистентності, що підтримує гомеостаз організму. Система інтерферонів має регуляторну функцію в організмі, тому що здатна модифікувати різні біохімічні процеси. Інтерферони хребетних, у тому числі людини, розділяють на три групи; а, Р, у, відповідно, лейкоцитарні, фібробласт й імунні.

Наприкінці 70-х рр. стала очевидною потенційна значимість інтерферонів для медицини, у тому числі профілактики онкологічних захворювань. Клінічні випробування стримувалися відсутністю достатніх кількостей інтерферонів і високою вартістю препаратів, отриманих традиційним способом (виділення із крові). Так, у 1978 р. для одержання 0,1 г чистого інтерферону в Центральній лабораторії охорони здоров'я Хельсінкі (лабораторія − світовий лідер у виробництві інтерферону з лейкоцитів здорових людей) переробляли 50000 л крові. Така кількість препарату приблизно могла забезпечити лікування проти вірусної інфекції 10000 випадків. Перспективи одержання інтерферонів пов'язували з генною інженерією.

У 1980 р. В. Плберту й А. Вейссману в СІМА вдалося отримати інтерферон у генетично сконструйованій Е. coli. Вихідні труднощі, з якими вони зіткнулися, − низький рівень мРНК у лейкоцитах, навіть стимульованих ураженням вірусом. За переробки 17 л крові вдалося виділити мРНК і одержати ДНК-копію. Останню вмонтували до плазміди й клонували в Е. coli. Було випробувано понад 20000 клонів. Окремі клони були здатні до синтезу інтерферону, але з низьким виходом − 1...2 молекули на клітину. Аналогічні дослідження здійснювали в Японії, Англії, Франції, Росії.

У 1980 р.було встановлено нуклеотидні послідовності - і -інтерферонів: мРНК фібробласного інтерферону складається з 836 нуклеотидів; з них 72 і 203 нуклеотиди припадають на 5'- і 3'-нетрансльовані ділянки, 63 кодують пептид, що відповідає за секрецію інтерферону із клітин, і 498 нуклеотидів кодують 166 амінокислотних залишків − власне інтерферону. Після цього хімічним синтезом було отримано гени - і -інтерферонів, які клонували в Е. соli. У 1981 р. розшифрували нуклеотидну послідовність імунного інтерферону, що значно відрізнявся від перших двох, але порівнювався за величиною молекули. Істотним моментом був повний синтез гена лейкоцитарного інтерферону людини, здійснений у Великобританії співробітниками фірми «Імперіал кемікаліндастрі» і Школи біологічних наук Лестерського університету. За півтора року була синтезована повна послідовність ДНК-копії інтерферону, здатна кодувати оц-інтерферон. Синтез олігонуклеотидів здійснили новим методом, що дуже прискорив синтез гена. Спочатку до поліакриламідної смоли був приєднаний нуклеотид, далі здійснювали приєднання пар нуклеотидів, використовуючи агент, що конденсує у безводному піридині. Кожний цикл тривав півтори години, тому протягом року можна було синтезувати послідовність завдовжки в 5000 нуклеотидів. Було синтезовано 67 олігонуклеотидів, які за допомогою лігази з'єднали у дволанцюгову ДНК, що складається з 514 пар нуклеотидів. Отриманий ген вбудовували в клітини двох бактерій: Е. соliта Меthуlорhіlus теthуlоtrоhus, в яких відбувалась експресія.

Зусилля, спрямовані на одержання генно-інженерних інтерферонів, порівняно з методом культури клітин, дозволили знизити витрати більш ніж у 100 разів. Було отримано різні типи інтерферонів на основі генно-інженерних клітин бактерій і дріжджів. Це дало змогу розгорнути медико-біологічні й клінічні випробування препаратів. Одержувані протягом 1980-1981 рр. препарати інтерферонів було очищено на 80% і вони мали питому активність більше 107 міжнародних одиниць на 1 мг білка. Розширення клінічних випробувань інтерферонів, розпочатих у цей період, залежало від підвищення ступеня їх очищення. Прогрес у цьому напрямку був досягнутий застосуванням моноклональних антитіл, які можна використовувати для афінної хроматографії (при цьому необхідні білки затримуються у колонці з антитілами).

Технологічна схема одержання генно-інженерних інтерферонів (як одна з можливих) принципово зводиться до такого:

1. індукція синтезу й виділення інтерфероновоїмРНК із клітин;

2. одержання кДНК, комплементарної інтерфероновоїмРНК із лейкоцитів;

3. вбудовування кДНК у плазміду;

4. уведення реконструйованої плазміди в клітини Е. соli;

5. розмноження бактерій, що містять реконструйовану плазміду, у культуральному середовищі;

6.сепарування клітин Е. соli;

7. дезінтеграція й екстракція клітин Е. соli;

8. осадження (наприклад, поліетиленаміном) з наступним центрифугуванням;

9. висолювання інтерферону із супернатанта сульфатом амонію;

10.діаліз осаду інтерферону;

11. розчинення інтерферону, пропущення розчину через колонку з імуносорбентом (пришитими моноклональними антитілами, рис. 40);

12. елюірування інтерферону з наступною хроматографією на целюлозному катіонообміннику.

Рис. 40. Схема очищення рекомбінантних інтерферонів за допомогою моноклональних антитіл:

1. - діаліз із інтерфероном та іншимибактеріальними білками;

2. інтерферон;

3. - баластні білки;

4. - моноклональні антитіла (МкАТ);

5. - інтерферон, що зв'язався з МкАТ;

6. - слабка кислота

Із зазначених 12 стадій тільки 8 останніх фактично реалізуються на виробництві, в той час як перші 4 стадії виконуються в лабораторних умовах. До речі сказати, ці 4 стадії найбільш важкі й складні (рис. 41).

Бактерії з генами інтерферону людини продукують специфічний білок у кількості 200...250 мкг/л бактеріальної суспензії. Крім Е. соliвдається одержувати людський інтерферон за допомогою Вас. sиbtilis, здатну секретувати синтезовані білки до навколишнього середовища (в Е. соliвони накопичуються в периплазматичному просторі), а також за допомогою Saccharomycescerevisiae, що ростуть на середовищах з більш дешевими субстратами. На них не діють фаги, вони крупніші за бактерій і легше сепаруються, у їхніх клітинах здійснюється процесінгпреінтерферонів. Застосовують, також, культури бактерій з родин Меthуlотопаs, Рsеиdотопаs, Sаlтопеllа. Усі названі мікроорганізми конститутивно (не адаптивно) утворюють інтерферони, що не відрізняються від природних. Проти всіх класів інтерферонів отримані моноклональні антитіла, за допомогою яких проводять швидке й високоякісне очищення продуктів, застосовуючиімуноафину хроматографію.

Рис. 41. Етапи клонування гена інтерферону:

1. - мРНК інтерферону з індукованих клітин;

2. - кДНКікомплементарнаодноланцюгова ДНК; 2, а - кДНК₂ комплементарна дволанцюгова ДНК;

3. - зворотна транскриптаза;

4. - синтез дволанцюгової ДНК; - кінцева трансфераза;

5. - рестрикція;

6. - кДНК з липкими кінцями;

7. - відпалювання;

8. - ДНК інтерферону;

9. 10введення в клітини Е. соїі

10. рекомбінантноїплазміди; КО - клонування і відбір колоній; БРП - «бібліотека»

11. рекомбінантних плазмід

Інтерферони володіють двома типами біологічної активності противірусної й протиклітинної. Відносно вірусів дія трьох інтерферонів майже однакова за ефективністю, але відносно клітин більш активний у-інтерферон, причому, проти пухлинних клітин він активніший, ніж проти нормальних клітин. На практиці інтерферони застосовують за вірусних інфекцій, ревматоїдного артриту (у-інтерферон), імунопатології та в онкології.

Інтерферони а (ІФ ) кодуються родиною генів, що складається, приблизно, з 20 ніалельних генів. Підтипи ІФ виявляють різну специфічність і мають свої особливості. Поєднати ці особливості в одній молекулі ІФа можливо за рахунок створення комбінованого гібридного гена (рис. 42).

Порівняння послідовностей кДНК ІФа₂ і ІФа₃ показало, що вони містять однакові сайти рестрикції RЕ1, RЕ2, RЕЗ в позиціях 60, 92 і 150 п.н. Після розщеплення і наступного лігірування фрагментів було отримано декілька гібридних генів. Виявилося, що в ряді випадків властивості гібридів різко відрізняються від початкових індивідуальних ІФ.

Рис. 42. Одержання гібридних генів інтерферону людини