Раздел 1. Техника гистологического исследования Тема: этапы приготовления гистологического препарата методы и техника микроскопии

Световой микроскоп состоит из:

-Оптической части - объектив, окуляр, осветительное устройство,

- Механической части - штатив, колонка с микро- и макровинтами и тубус.

Электронный микроскоп включает в себя электронную пушку, в качестве линз - электромагнитные катушки, колонну, люминесцентный экран. Изображение можно изучать на этом экране, фотографировать, фиксировать для последующего в памяти компьютера.

Разрешающая способность - наименьшее расстояние между двумя точками, которые воспринимаются раздельно, у светового микроскопа она составляет 0,2 - 0,4 мкм, у электронного микроскопа - 0,2 нм.

Гистологический препарат постоянный - это окрашенный срез органа или ткани толщиной 5 -15 мкм, забальзамированный и расположенный между предметным и покровным стеклами. Временный гистологический препарат заключают в воду или глицерин.

Основные этапы приготовления гистологического препарата

Фиксация материала - стабилизация живой системы путем остановки в ней жизненных процессов за счёт коагуляции белков или удаления воды. Фиксаторы должны действовать быстро и сами не вызывать видимых структурных изменений.

Простые фиксаторы - формалин, этанол, пикриновая кислота и др.; электронной микроскопии используют в качестве фиксатора тетраоксид осмия -фиксирует фосфолипиды и глютаральдегид – фиксирует белки.

Сложные фиксаторы - смеси веществ. Например, смесь Буэна - формалин + пикриновая кислота; жидкость Ценкера - уксусная кислота + сулема + бихромат калия + сульфат натрия.

Уплотнение материала - необходимо, чтобы изготовить гистологический срез. Для этого материал обезвоживают путем проводки по этанолам возрастающей концентрации и заливают в парафин или целлоидин. Недостаток парафиновой заливки - сморщивание объекта, целлоидиновой - невозможно получить срез тоньше 7-8 мкм, трудно получить серийные срезы. Для уплотнения материала можно использовать метод замораживания объекта, но для этого необходимо специальное оборудование. Для электронной микроскопии материал заливают в полимеризующиеся эпоксидные смолы.

Изготовление срезов - гистологические срезы изготавливают при помощи микротомов. Различают санные и ротационные микротомы. Замороженные срезы изготавливают на микротомах со специальным охладительным столиком. Срезы делают острыми ножами из стали или стекла. Толщина среза для световой микроскопии при парафиновой заливке - 4-5 мкм, при целлоидиновой - 7-8 мкм, для электронной микроскопии - 30₇50 нм. В микротоме выделяют держатель ножа, объектодержатель и механическую систему подачи объектодержателя вместе с объектом.

Окрашивание срезов - для того, чтобы гистологические структуры сделать контрастными, их окрашивают специальными красителями. Основные красители -гематоксилин, толуидиновый синий, азур-II, кармин и др. Способность окрашиваться этими красителями называется базофилией, а структуры, связывающие эти красители, - базофильными (ДНК, РНК, рибосомы, цитоплазматическая сеть шероховатого типа).

Метахромазия - изменение цвета основных красителей при их связывании со структурами, в которых много сульфатированных гликозаминогликанов. Метахромазию дают гранулы тучных клеток, базофильных лейкоцитов, межклеточное вещество хряща. Кислые красители - эозин, кислый фуксин и др., окрашивают цитоплазму и многие неклеточные структуры, называемые оксифильными. Для выявления отдельных структур или веществ применяют специальные красители. Например, азур-II + эозин используют для окраски мазков крови, судан III - для окраски липидов, импрегнация серебром - для выявления структур нервной ткани. В электронном микроскопе ультраструктуры выглядят черно-белыми. В этом случае для их контрастирования (окрашивания) применяют соли тяжелых металлов - свинца, вольфрама, урана, марганца, кобальта. Разновидностью специальных методов окраски являются вещества, применяемые в цито- и гистохимии.

Заключение срезов - для консервации срезов используют смолы хвойных деревьев (канадский и перуанский бальзамы), поскольку они обладают коэффициентом преломления, близким к таковому у стекла. После нанесения капли бальзама срез накрывают покровным стеклом.