Практическая часть Специфичность действия ферментов

Специфичность действия ферментов можно наблюдать на примере амилазы слюны, субстратом для которой является крахмал или гликоген.

Амилаза расщепляет крахмал через стадию декстринов до редуцирующего дисахарида – мальтозы.

О действии фермента можно судить или по исчезновению (расщеплению) субстрата или по образованию конечных продуктов его расщепления.

Принцип метода: -амилаза слюны катализирует гидролиз -1-4 гликозидных связей в крахмале и гликогене, что приводит к расщеплению (убыли) субстрата и появлению продуктов гидролиза – декстринов и дисахарида мальтозы. Определяя убыль субстрата (крахмала) с помощью реакции с реактивом Люголя (раствор йода в KI), судят о наличии в слюне фермента амилазы. Крахмал открывается пробой Люголя. Как известно, крахмал со свободным иодом дает синее окрашивание.

Конечные продукты расщепления крахмала можно обнаружить с помощью редуцирующих проб, например, пробой Фелинга. Реакция основана на способности углеводов восстанавливать металлы. При нагревании голубой гидрат окиси меди восстанавливается углеводом сначала в гидрат закиси меди желтого цвета, а при дальнейшем нагревании в закись меди кирпично-красного цвета.

Химизм реакции:

-амилаза -амилаза

( С₆ Н₁₀ О₅)_n +н₂о декстрины +н₂о _n(С₁₂ Н₂₂ О₁₁)

крахмал мальтоза

Ход работы:

В пробирку 1 отмерить 2 мл 0,5 раствора крахмала, в пробирку 2 – 2 мл 2% раствора сахарозы. В обе пробирки добавить по 1 мл разведенной в 10 раз слюны. Пробирки встряхнуть и поместить в термостат или водяную баню при температуре 38С на 10 минут. После этого с содержимым каждой пробирки проделать пробы Фелинга и Люголя. Для контроля провести с 0,5 % раствором крахмала пробу Люголя и пробу Фелинга с 2% раствором сахарозы.

N пробирки	Источник фермента	Субстрат	Реакция с раствором Люголя (окраска)	Проба Фелинга	Вывод

Влияние температуры на активность фермента

-амилазы слюны (термолабильность ферментов)

Активность ферментов зависит от температуры. Та температура, при которой активность фермента наибольшая, называется температурным оптимумом (opt-t). Для организма человека opt-t находится в пределах 37-40С. Снижение t приводит к уменьшению активности ферментов, и при очень низких температурах (О - +4С) ферментативная активность практически прекращается, т.к. резко изменяются кинетические свойства ферментов. Поэтому снижение активности ферментов имеет обратимый характер: при повышении температуры ферментативная активность полностью восстанавливается.

Повышение t выше opt-t приводит к постепенному снижению активности и при достижении определенной t для каждого фермента – к полной инактивации фермента, которая является необратимой. При t - 60С, (для некоторых 70-100С) происходит денатурация белка-фермента, разрушение активного центра фермента, образование Е-S-комплекса становится невозможным, и ферментативная реакция прекращается.

( На термолабильность ферментов определенное влияние оказывают концентрация S, рН среды и др. факторы.)

Ход работы

В 4 пробирки отмерить по 4 мл 0,5% раствора крахмала и по 1 мл слюны, разведенной в 10 раз. Пробирку 1 поместить в кипящую баню, 2 пробирку в ледяную баню, пробирку 3 –в термостат при температуре 38С, пробирку 4 оставить при комнатной температуре. Через 10 минут содержимое каждой пробирки разделить на 2 части и провести пробу Фелинга, а с другой частью –пробу Люголя.

Реакция Люголя. Реакция обнаруживает крахмал. К содержимому пробирки добавить 1 каплю раствора Люголя. Появление синего окрашивания свидетельствует о наличии крахмала.

Реакция Фелинга. К содержимому пробирки добавить примерно половину объема 10% раствора КОН и по каплям 1% раствора CuSO₄ до образования неисчезающей мути на фоне голубой окраски раствора. Верхний слой жидкости нагреть на пламени спиртовки. Появление желтого окрашивания, преходящего в кирпично-красное, указывает на наличие редуцирующих углеводов.

Результат оформляют в виде таблицы, объясняют причины разной активности -амилазы в зависимости от температуры.

Nпроб	Температура С	Реакция с реактивом Люголя	Проба Фелинга	выводы
1
2
3
4

Влияние рН на активность амилазы

Оптимум - рН для различных ферментов имеет различное значение, это зависит от аминокислотного состава ферментов,

оpt рН для -амилазы слюны – 6,8-7,0;

- липазы панкреатической – 7,0-8,5;

• пепсина 1,5 - 2,5;

• аргиназы – 9,5- 10,0;

• сахаразы кишечной- 5,8-6,2.

Любое изменение реакции среды (в кислую или щелочную сторону от оптимума – рН) снижает активность фермента. Последнее связано с изменением диссоциации ионогенных групп ферментного белка (в том числе и в активном центре). В результате меняется конформация всей молекулы фермента и форма активного центра. Таким образом, комплементарность между субстратом и активным центра фермента нарушается, образование фермент-субстратного комплекса замедляется и активность фермента снижается.

Изменение диссоциации ионогенных групп может происходить и в некоторых субстратах, что также приводит к нарушению комплементарности между активным центром и субстратом.

Смещение же рН в сильно кислую или щелочную сторону может вызывать денатурацию ферментного белка, потерю нативной конформации и разрушение активного центра фермента. Последнее исключает возможность образования фермент-субстратного комплекса и приводит к инактивации фермента.

Ход работы

1.В три пробирки вносят по 3 мл буферных растворов с рН 2,0; 7,0; 9,0.

2.Во все пробирки прибавляют по 2 мл 0,5% раствора крахмала и по 1 мл разбавленной в 10 раз слюны. Содержимое пробирок перемешивают и помещают в термостат при 40С на 10 минут.

3.Пробирки охлаждают, и с содержимым проделывают реакции Люголя и реакцию Фелинга. При этом следует учесть, что реакция на крахмал с раствором Люголя положительна только в кислой или нейтральной среде, а проба Фелинга протекает в щелочной среде. (Принцип метода: Проба Фелинга и Ниландера основаны на восстановительных свойствах глюкозы, которая в щелочной среде при нагревании, окисляясь восстанавливает металл (в пробе Фелинга до Сu₂О - красный цвет, в пробе Ниландера до свободного Bi - черный цвет).

ПРОБА ФЕЛИНГА.

К I мл исследуемого раствора (мочи) приливают 0,5 мл реактива Фелинга, нагревают пробирку до кипячения и кипятят I мин. В случае положительной реакции на глюкозу наблюдается красное окрашивание вследствие образования оксида меди (Сu₂O).

4.Наблюдают результаты и данные вносят в таблицу.

Nпроб	Рh среды	Реакция с реактивом Люголя	Проба Фелинга	Выводы
1
2
3
4