Техника приготовления препаратов-мазков, их фиксация и окраска

Для количественного учета, изучения морфологии, выявления спор, капсул, органоидов, включений препарат-мазок необходимо зафиксировать и окрасить.

1 этап. Обезжирить стекло, протерев рабочую поверхность стекла мылом, которое затем удаляют салфеткой.

2 этап. Если микроорганизмы выращены на плотной питательной среде, то на обезжиренное стекло наносят каплю физиологического раствора и в нее вносят петлей небольшое количество материала, который распределяют тонким слоем на поверхности около 2 см².

3 этап. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют. В процессе фиксации микробные клетки погибают, этим достигается безопасность работы с ними. Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители, чем живые. В фиксированном мазке клетки прикрепляются к стеклу и не смываются при последующей обработке.

Методы фиксации

Физический метод	Химический метод
Фиксация мазка над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх	Мазок погружают в фиксатор на определенное время. В качестве фиксатора используют: этанол – 10-15 мин; ацетон – 5 мин; смесь Никифорова (этанол +эфир – 1:1) – 10-15 мин и др.

Методы окраски

Простые методы (ориентировочные)	Сложные методы (дифференцирующие)
1. Применяют для изучения морфологии микроорганизмов. 2. Окрашивают одним красителем анилино-вого ряда (основным или кислым): кислый фуксин, метиленовый синий, эозин, генциановый фиолетовый.	1. Применяют для изучения структуры клеток, дифференциации микроорганизмов. 2. Используют несколько красителей. Окраска по методу: Грама, Циля-Нильсена, Ожешко, Романовского-Гимза, Нейссера Гинса-Бурри и др.

Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, в которых красящий ион - катион.

Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашены.

Окраска по Граму. Сущность метода

Метод основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Методика окраски по Граму

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты, затем краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1 мин.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Препарат промывают водой.

5. Мазок докрашивают водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Этапы окраски по Граму представлены на стенде.

Окраска по Цилю-Нильсену.

Применяют для дифференциации кислотоустойчивых и некислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость бактерий обусловлена повышенным содержанием в клеточной стенке и цитоплазме липидов, воска и оксикислот. Принцип основан на том, что кислотоустойчивые бактерии за счет содержания указанных веществ прочно связывают карболовый фуксин при нагревании (т.е. окрашиваются в красный цвет) и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются серной кислотой и при использовании дополнительного красителя - метиленового синего – окрашиваются в синий свет.

Методика окраски по Цилю-Нильсену:

1. На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин.

2. Снять бумагу, промыть мазок водой.

3. Нанести 5 % раствор серной кислоты на 1-2 мин до обесцвечивания.

4. Промыть водой.

5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.

6. Промыть водой, высушить, микроскопировать.

Окраска по Ожешко

Метод основан на принципе окраски кислотоустойчивых бактерий. Отличие заключается в предварительной обработке микроорганизмов 0,5 % раствором соляной кислотой, что облегчает окраску спор карболовым фуксином. Споры кислотоустойчивы, поэтому красятся в красный цвет.

Методика окраски по Ожешко:

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор соляной кислотой и подогреть на пламени в течение 2-3 мин.

2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы - синий.

Окраска по Романовского-Гимза.

Методика окраски по Романовскому-Гимза:

Краска Романовского-Гимза состоит из метиленового синего, эозина и азура.

1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин.

2. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.

К работе № 3 Теоретическая справка