Мал золотник, да дорог

Рис. 2  Канонические уотсон-криковские (WC) пары оснований в ДНК. Стрелками показаны места, куда привносятся метилъные группы.

Уже более полувека известно, что наряду с классическими четырьмя основаниями (аденин, гуанин, цитозин и тимин) в ДНК могут встречаться необычные метилированные основания 5-метилцитозин(m⁵C) и N⁶-метиладенин (m⁶A), получившие название минорных. Мы не знаем, сколько крови попортили эти миноры авторам двойной спирали в то время они уже были найдены в ДНК, но было непонятно, откуда они берутся. Лишь в 1961 году у бактерий, а затем у эукариот обнаружили ферменты, которые в присутствии донора метильных группS-аденозилметионина избирательно метилируют отдельные остатки цитозина или аденина в цепях ДНК. Стало ясно, что минорные основания не встраиваются в ДНК в готовом виде, а возникают в результате энзиматической модификации (метилирования) обычных оснований в уже сформированных или формирующихся цепях (рис 2). Однако долгое время оставалось неясным, зачем это нужно клетке и почему модифицируются не все, а только некоторые аденины и цитозины.

И у нас, и за рубежом принято было считать, что эти минорные основания не играют существенной роли ни в структуре ДНК, ни в её функционировании. В качестве доказательства привлекали излюбленный объект классических генетиков — плодовую мушку дрозофилу. В геноме этого насекомого долго никому не удавалось найти минорные основания. Это давало повод глубокоуважаемым столпам генетики (их имена я намеренно не упоминаю) утверждать, что если дрозофила прекрасно живёт без метилирования ДНК, то эта модификация генома вообще не должна иметь значения в жизнедеятельности эукариотических организмов. Долгие годы это заметно охлаждало интерес к метилированию ДНК у многих блестящих биохимиков и молекулярных биологов мира — и позволило нам в более или менее спокойной обстановке шаг за шагом идти по пути исследования метилирования ДНК.

Подобно великому русскому учёному И.П. Павлову, поставившему памятник собаке, и мне следовало бы отлить памятник дрозофиле (из-занебольших размеров мушки это было бы значительно дешевле). И не только потому, что она служила и служит бесценным биологическим объектом, а потому, что она позволила мне, моим коллегам и ученикам работать без присущего нашему времени ажиотажа и головокружительной гонки. Кстати, сейчас доказано, что и у дрозофилы ДНК метилирована и эта модификация генома важна для развития насекомого.

Мы всегда были убеждены в том, что минорные основания в ДНК и сама эта энзиматическая модификация генома обязательно должны сказываться на биологических функциях генома. „Если звёзды зажигают, значит, это кому-то нужно“.

Физика, органическая химия, энзимология…

Для начала несколько слов о влиянии метилирования на структуру ДНК. Нам удалось найти такую необычную природную двутяжевую ДНК(у бактериофага AR9 Bacillus brews), в которой вместо обычного для ДНК тимина присутствует характерное для РНК основание урацил. Грубо говоря, урацил — тот же тимин, но без метильной группы. Урацилсодержащая ДНК бактериофага плавилась (денатурировала) при гораздо более низкой температуре, чем идентичная ей по составу нормальная, тиминсодержащая ДНК. Стало ясно, что метилирование остатков цитозина небезразлично для самой структуры ДНК: оно стабилизирует двутяжевую спираль.

Ещё сильней привлекло нас то, что метилирование ДНК ощутимо сказывается на её взаимодействии (связывании) с различными белками. Во многих случаях метилирование по цитозиновым остаткам препятствует связыванию специфично реагирующих с ДНК ядерных белков(факторов), которые, собственно, и осуществляют разные генетические процессы, в том числе транскрипцию, репликацию и репарацию. С другой стороны, теперь уже известны и так называемые m⁵C-связывающие белки, которые, присоединившись в метилированных участках к ДНК, специфично аранжируют на ней весь ансамбль сложных белковых комплексов, контролирующих экспрессию генов. Слово „аранжировать“ молекулярные биологи употребляют примерно в том же смысле, что музыканты и составители букетов: в основном сохраняя содержание и варьируя форму, изменять смысл и характер действия. Вот вам и „не играет роли“…

Рис. 3  Неэнзиматическое метилирование ДНК. Когда цитозин превращается в метилцитозин, „любовь“ между ним и гуанином становится ещё крепче (♥), но после дезаминирования и возникновения тимина на смену „любви“ приходит „пиковый интерес“ — основания больше не спарены. Это приводит к замене пары CG на пару ТА, то есть к мутации

А если без всяких белков взять да проинкубировать ДНК с меченым по метильной группе S-аденозилметионином(донором метильных групп), то через некоторое время радиоктивность обнаруживается уже в составе ДНК в виде вновь возникших в ней остатков 5-метилцитозина и тимина (рис. 3). Так было открыто неферментативное метилирование ДНК. Интересно, что меченый тимин в ДНК обнаруживался при этом в гораздо более заметных количествах, чем m⁵C. Тем самым было выявлено, что неэнзиматическое метилирование ДНК в водном растворе сопровождается быстрым окислительным дезаминированием возникших остатков m⁵C с превращением их в остатки тимина. Это доказывало, что метилирование остатков цитозина в ДНК может приводить к С→Т-транзиции(в результате чего пара GC превратится в пару AT), следовательно, остатки 5-метилцитозина — горячие мутационные точки. Это явление лежит в основе широко распространённого исчезновения (супрессии) некоторых (CpG)-последовательностейиз генов и геномов разнообразных организмов. Супрессия CpG — один из магистральных путей природного мутагенеза и эволюции.

Коль скоро метилирование ДНК возможно, по-видимому, оно и было использовано появившимися в эволюции ферментамиДНК-метилтрансферазами. Эти ферменты умеют метилировать цитозиновые или адениновые остатки не хаотично, как в предыдущем случае, а в строго определённых последовательностях. Далее эти ферменты я буду называть просто ДНК-метилазами.

Рис. 4  Комплекс фермента цитозиновойДНК-метилтрансферазы с ДНК.

На рис. 4 можно видеть, как лихо одна из бактериальных ДНК-метилаз расправляется с ДНК. Сначала фермент узнаёт подходящий участок ДНК, в этом месте ковалентно связывается с ней и буквально выворачивает цитозин наружу двойной спирали, насаживая на него метильную группу. Затем фермент отщепляется и модифицированное основание возвращается на место. Все эти подробности стали известны недавно благодаря блестящему рентгеноструктурному исследованию кристаллов ДНК-фермент нашими американскими коллегами (АйраШильдкраут и другие). В своё время мы расшифровали одну из самых первых таких последовательностей ДНК у бактерий. Оказалось, что в клетках Bac. brewis ДНК-метилазаметилирует цитозиновые остатки в последовательности (5’) N’ G C T G С N… (3’).(Подчёркнут остаток, подвергающийся метилированию.) Позднее это было подтверждено в работах нобелевского лауреата Р. Робертса.

Метилирование ДНК у бактерий лежит в основе явления так называемой хозяйскойрестрикции-модификации. Бактериофаг, выращенный в клетках того или иного штамма бактерии, приобретает хозяйскую специфичность: он способен заражать только клетки этого штамма, поскольку ДНК бактериофага обработана ДНК-метилазами бактерии-хозяина и тем самым защищена от расщепления хозяйскими ферментами эндонуклеазами. Мы установили, что метилирование адениновых остатков у бактериофага Т₂ и его хозяина E. coli действительно идёт в одних и тех же последовательностях (это и значило, что над ДНК бактерии и фага, скорее всего, потрудился один и тот же фермент). Ещё до этого мы убедились в том, что ДНК у разных бактерий метилирована по-разному, то есть была установлена штаммовая специфичность её метилирования.

Это было только самое начало. Предстояло ещё выяснить, какова химическая и биологическая специфичность метилирования ДНК у эукариотических организмов, в том числе у растений и животных.