10

№12. Микробиологические исследования отделяемого глаз и ушей.

Возбудителями воспалительных заболеваний глаз могут быть как микроорганизмы, вызывающие воспалительные заболевания других систем и органов, так и микроорганизмы, обусловливающие только конъюнктивиты.

При воспалительных заболеваниях уха возбудителями их могут быть явиться микроорганизмы, представляющие нормальную микрофлору, так и относительно патогенные микроорганизмы.

Основные учебные вопросы:

1. Нормальная микрофлора конъюнктивы глаза. Роль в развитии заболеваний. Основные возбудители инфекционных заболеваний конъюнктивы, век, слезных мешков, роговицы.

2. Способы взятия материала c конъюктивы, края век, роговицы. Микроскопия Первичный посев. Среды первичного посева.

3. Основные возбудители инфекционных заболеваний конъюнктивы, век, слезных мешков, роговицы. Возбудители конъюнктивитов: Haemophilus aegypticus, Moraxella lacunata, Branchamella catarrhalis.. Общие сведения, классификация. Выделение и идентификация.

4. Выделение и идентификация возбудителей патологии глаз стафилококковой и стрептококковой этиологии (S.aureus, S.epidermidis, S.pyogenes, S.viridans, E.faecalis).

5. Диагностика специфических коньюнктивитов, вызванных Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Chlamidia trachomatis.

6. Выделение и идентификация других возбудителей-оппортунистов (Proteus, Klebsiella, Escherichia, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes, грибов рода Сandida, Aspergillus).

7. Определение чувствительности и подбор антибактериальных препаратов для лечения заболеваний глаз.

8. Нормальная микрофлора наружного уха и слухового прохода. Роль в развитии заболеваний.

9. Взятие материала. Микроскопия. Среды первичного посева.

10. Возбудители острых отитов: S.aureus, S.epidermidis, S.pyogenes, S.viridans, S.pneumoniae, Haemophilus influenzae, E. coli, C. diphtheriae, Васteroides. Возбудители хронических отитов: Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Pseudomonas, Mycobacterium tuberculosis, Actinomyces, плесневые грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor. Выделение и идентификация. Оценка результатов.

11. Подбор антибактериальных препаратов и определение чувствительности к ним. Контроль эффективности проводимого лечения.

Вспомогательные материалы по теме:

Микробиологическая диагностика проводится при заболеваниях глаза и его придатков. Ниже перечислены основные возбудители инфекционных заболеваний глаза и его придатков

Заболевание		Бактерии
Блефарит		Staphylococcus aureus (+)A, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema perteneum
Конъюнктивит, кератит, кератоконъюнктивит		Streptococcus pneumoniae (+)A, Haemophilus influenzae (-)A, Haemophilus pyogenes (+)A, Staphylococcus aureus (+)A, Neisseria gonorrhoeae(-)A, Neisseria meningitidis(-)A, Moraxella spp. (-)A, Serratia spp.(-)А
Офтальмит новорожденных		Neisseria gonorrhoeae(-)A
Эндофтальмит		Staphylococcus aureus(+)A, Pseudomonas aeruginosa (-)A, Escherichia coli (-)A, Klebsiella spp. (-)A, Proteus spp. (-)A, Enterobacter spp. (-)A
Иридоциклит	Treponema pallidum
Хориоретинит	Mycobacterium tuberculosis
Воспаление протоков слезных желез	Bacteroides spp. (-)Ан, Fusobacterium spp. (-)Ан, Peptostreptococcus spp. (+)Ан
Дакриоцистит—острый хронический	Staphylococcus aureus(+)A Streptococcus pneumoniae (+)A, Staphylococus aureus(+)A, Pseudomonas spp. (-)A
Воспаление в орбитальной области	Staphylococcus aureus(+)A, Streptococcus pneumoniae (+)A, Streptococcus pyogenes(+)A

При воспалительных заболеваниях наружного, среднего и внутреннего уха исследуют гнойное или серозное отделяемое. Ниже перечислены основные возбудители заболеваний ушей.

Заболевание	Бактерии
Наружный инфекционныотит	Pseudomonas aeruginosa (-)A, Escherichia coli (-)A, Staphylococcus aureus(+)A, Proteus spp. (-)A, Streptococcus spp. (+)A
Средний отит -острый -хронический	Streptococcus pneumoniae (+)A, Haemophilus influenzae (-)A, Staphylococcus aureus(+)A, Streptococcus pyogenes(+)A, Branhamella cataralis (-) A Смешанная флора в 40% случаев Pseudomonas aeruginosa (-)A, Haemophilus influenzae (-)A, Staphylococcus aureus(+)A, Klebsiella pneumoniae (-)A, Proteus spp. (-)A, Bacteroides spp. (-)Aн, Fusobacterium spp. (-)Ан, Peptostreptococcus spp. (+)Ан
Серозный средний отит	Смешанная флора в 40% случаев Pseudomonas aeruginosa (-)A, Haemophilus influenzae (-)A, Staphylococcus aureus(+)A, , Klebsiella pneumoniae (-)A, Proteus spp. (-)A, Bacteroides spp. (-)Aн, Fusobacterium spp. (-)Ан, Peptostreptococcus spp. (+)Ан

(-)-грамотрицательные, (+)-грамположительные, А-аэробы, Ан-анаэробы, подчёркнута нормальная микрофлора.

Микробиологическая диагностика отделяемого глаз.

БИОМАТЕРИАЛЫ ПРИ ИНФЕКЦИЯХ ГЛАЗ

Воспалительные заболевания глаз, сопровождающиеся острым или хроническим течением, могут быть обусловлены разными микробами в зависимости от локализации и тяжести процесса. Инфекции включают несколько нозологических форм и синдромов.

Конъюнктивит представляет собой острое или хроническое воспаление конъюнктивы - слизистой оболочки, покрывающей переднюю поверхность (склеры) глаза. Симптоматика может быть одно- или двухсторонней и выражается покраснением конъюнктивы, слезоточивостью и наличием гнойного отделяемого. Источником инфекции обычно являются экзогенные микробы с ресниц, рук, окружающей среды и др., но также может быть и гематогенное инфицирование.

Наиболее частыми инфекционными агентами являются: H.influenzae (особенно биовар III) или H.aegyptius, S.aureus, S.pneumoniae, N. gonorrhoeae. У лиц с иммунодефицитами встречаются представители семейства Enterobacteriaceae, P.aeruginosa. Так называемый конъюнктивит с включениями обусловлен хламидийной инфекцией.

Бактериальный кератит - воспаление роговой оболочки - проявляется разнообразной симптоматикой в зависимости от степени распространения процесса, начиная от поверхностного инфицирования эпителия роговицы и заканчивая глубоким изъязвлением стромы, вплоть до ее перфорации и потери глаза, что требует проведения незамедлительного и тщательного бактериологического исследования. Предрасполагающими факторами к изъязвлению роговицы являются первичные заболевания глаз, ношение контактных линз, местное применение кортикостероидов. Кроме того, группу риска составляют алкоголики, ожоговые больные и лица с иммунодефицитами. Ведущие симптомы: покраснение глаз, воспаление конъюнктивы, нарастающая боль, ухудшение зрения и светобоязнь. У пациентов возникает ощущение инородного тела в глазу, сопровождающееся слезотечением и образованием экссудата.

Наиболее частые возбудители - P.aeruginosa (вызывает бурное развитие процесса, который может закончиться прободением роговицы в течение нескольких часов), S.pneumoniae, Moraxella spp., зеленящие стрептококки, S.aureus, коагулазо(-) стафилококки. Реже встречаются Enterobacteriaceae, N.gonorrhoeae, N.meningitidis, H.influenzae, быстрорастущие микобактерии, актиномицеты, Propionobacterium acnes, Clostridium perfringens. При ношении контактных линз инфекция возникает с участием Bacillus spp., Serratia spp., Acanthamoeba spp.

Бактериальный эндофтальмит - воспаление полостей глаза и внутриглазных тканей (сосудистой и сетчатой оболочек) - наиболее серьезное и опасное для потери зрения инфекционное заболевание, возникающее вследствие травмы глаза, включая хирургические вмешательства, ранения и ушибы, или после нагноения роговицы и ее перфорации. Эндогенная инфекция может быть следствием сепсиса или распространяться из прилегающих участков, например, при целлюлите. Хирургическая инфекция обычно возникает в течение 72 часов после операции и проявляется в виде нарушения зрения, боли, скрытого отека, гиперемии конъюнктивы, локального иридоциклита (увеита). Послеоперационная инфекция (часто после удаления катаракты) может перейти в хроническую форму, длящуюся месяцами и даже годами.

Наиболее частые возбудители экзогенного эндофтальмита - S.aureus и коагулазо(-) стафилококки, S.pneumoniae, Streptococcus spp., P.aeruginosa, другие грам(-) палочки; при постхирургических инфекциях заметна роль Propionobacterium acnes, а в возникновении посттравматических инфекций принимают участие Bacillus cereus, B.licheniformis, B.subtilis, Clostridium spp. Эндофтальмит эндогенного происхождения чаще обусловлен S.aureus, S.pneumoniae, H.influenzae, N.meningitiis, Bacillus spp., быстро растущими микобактериями.

Пресептальный целлюлит - воспаление окружающей глазницу подкожной клетчатки - возникает в результате травмы или проникающего ранения; он также может возникнуть при распространении инфекции на фоне импетиго или эризипелоида.

Из возбудителей часто встречаются S.aureus, S.pyogenes, прочие стрептококки, H.influenzae (особенно у детей в возрасте от 6 до 30 мес.). При травмах инородными телами выделяют Clostridium spp. в монокультурах или в ассоциациях с аэробами. Реже встречаются Pseudomonas spp., другие грам(-) палочки.

Орбитальный целлюлит представляет собой серьезную системную инфекцию глубоких тканей глазницы, возникающую в результате травмы, хирургических вмешательств, распространения инфекции из околоносовых пазух или вследствие панофтальмита

При постхирургических инфекциях ведущим возбудителем является S.aureus, при инфекциях вследствие панофтальмита - S.aureus, S. pneumoniae, P.aeruginosa; при распространении инфекции из околоносовых пазух - H.influenzae (особенно у детей младше 5 лет), S.aureus, S.pyogenes, S.pneumoniae, грам(-) палочки.

Инфекции, связанные с воспалениями слезного аппарата, отличаются более легким течением.

Дакриоаденит - воспаление слезной железы. Основные возбудители - S.aureus, S.pyogenes, S.pneumoniae.

Дакриоцистит - воспаление слезного мешка. Основные возбудители - S.pneumoniae, S.aureus, S.pyogenes, H.influenzae.

Каналикулит - воспаление канальца. Основные возбудители -Actinomyces israelii, Propionobacterium (Arachnia) propionicus, Moraxella spp., «дифтероиды», зеленящие стрептококки.

Взятие материала для исследования.

В большинстве случаев материал обязан брать окулист. В сравнении с образцами из других локализаций материалы из глаз сразу же после взятия следует засевать непосредственно в среду культивирования, а не в транспортные среды. Посевы производят "у постели больного" (в стационаре или на дому) либо в кабинете врача при амбулаторном приеме. Способ взятия материала зависит от того, какая часть глаза поражена. Образцы, полученные инвазивными методами, должны всегда сопровождаться мазками с конъюнктивы, взятыми тампоном. Последние служат в качестве контроля при сравнении полученных результатов, являясь индикатором степени обсеменения материала бактериями внешней среды и окружающей глаз поверхностной микрофлоры, которой постоянно контаминирована конъюнктива.

Материал с конъюнктивы (при бактериальном конъюнктивите) и края века (при подозрении на стафилококковый блефароконъюнктивит):

• • Образцы берут стерильным, предварительно увлажненным ватным или пропитанным альгинатом кальция тампоном.

• • Кончиком тампона вращательными движениями по всей конъюнктиве собирают материал до применения каких-либо анестетиков. Для каждого глаза используют отдельный тампон.

• • Материал сразу засевают на агаровую среду (кровяной агар и шоколадный агар) горизонтальной штриховкой с конъюктивы правого глаза на одной половине чашки, на другой половине - вертикальной штриховкой с конъюнктивы левого глаза.

• • Другую агаровую чашку используют для посева материала с краев век, соответственно, правого и левого глаза на разных половинах чашки.

• • При взятии соскобов с конъюнктивы для приготовления мазков окулист должен соблюдать следующие правила:

• закапать в каждый глаз 1 -2 капли анестетика;

• с помощью шпателя Кимура аккуратно сделать соскоб конъюнктивы вдоль нижней правой тарзальной поверхности века;

• нанести материал на чистое предметное стекло и размазать его по поверхности круговыми движениями диаметром 1 см (готовят не менее двух препаратов), либо раздавить его между двумя стеклами, продвигая их в плотном соприкосновении в противоположных относительно друг друга направлениях;

• погрузить препараты в 95% спирт на 5 мин;

• повторить вышеуказанные процедуры для приготовления препаратов с конъюнктивы другого глаза;

• в качестве альтернативного варианта можно брать материал тампоном между верхней тарзальной поверхностью века и сводом глаза, однако этот способ менее результативен для выделения бактерий.

• • Посевы и препараты немедленно транспортируют в лабораторию.

Соскобы с роговицы:

• • Предварительно получают соскобы с конъюнктивы, как указано выше (сопоставление результатов посевов с конъюнктивы и роговицы в ряде случаев помогает исключить возможную контаминацию материалов с роговицы).

• • Закапывают в глаза 1 -2 капли анестетика.

• • Короткими уверенными движениями в одном направлении стерильным шпателем Кимура делают не менее 3-5 соскобов с изъязвленных участков роговицы (при широко открытых глазах пациента, стараясь не касаться ресниц).

• • Каждый соскоб засевают на несколько сред (кровяной агар, шоколадный агар, дополнительный кровяной агар и тиогликолевую среду для выделения анаэробов, и по показаниям - на картофельный агар с декстрозой для выделения грибов и среду для микобактерий). Необходимость взятия нескольких соскобов у больного продиктована тем, что микробы на пораженном участке по глубине и ширине располагаются неравномерно.

• • Готовят 2-3 мазка для окраски по Граму, как указано выше для соскобов с конъюнктивы.

• • Все посевы и препараты незамедлительно доставляют в лабораторию.

Внутриглазная жидкость (при эндофтальмите):

• • Предварительно берут соскоб с конъюнктивы для контроля возможной контаминации основного образца посторонней флорой.

• • Жидкость собирают путем пункции передней камеры глаза.

• • Если позволяет объем жидкости, ее транспортируют непосредственно в укупоренном шприце (предварительно удалив из него пузырьки воздуха) или в анаэробной транспортной системе. Если жидкости мало, ее засевают (по 1-2 капли) в питательные среды (кровяной и шоколадный агар, среду для анаэробов) непосредственно в процедурном кабинете.

• • Готовят мазки, раскапывая жидкость на чистые предметные стекла.

Материал при септальном целлюлите:

• • Окулист должен предварительно продезинфицировать кожу спиртом и йодным раствором.

• • Если нет открытой раны, делают надрез пораженного верхнего или нижнего века скальпелем.

• • Если рана открытая, врач берет гнойный материал иглой со шприцом.

• • Производят посев в культуральные среды (кровяной и шоколадный агар); часть материала вносят в анаэробную транспортную емкость.

• • Готовят мазки для окраски по Граму как указано выше.

Материалы при орбитальном целлюлите:

• • Получают аспират из раны как указано выше.

• • Производят посев на те же среды и готовят препараты для окраски по Граму так же, как при пресептальном целлюлите.

• • Исследуют кровь на гемокультуру.

При дакриоадените:

• • Собирают материал с конъюнктивы тампоном как указано выше.

• • Пункцию слезной железы для получения и исследования аспирата не проводят.

При дакриоцистите:

• • Получают и исследуют материал с конъюнктивы как указано выше.

• • Сдавливают слезный мешок для получения экссудата или собирают его шприцом.

• • Производят посев на культуральные среды (кровяной и шоколадный агар) и готовят препараты для окраски по Граму как указано выше.

• • При достаточном объеме материала помещают его в транспортную среду и доставляют в лабораторию.

При каналикулите:

• Сжимают внутренний край века для выдавливания гноя.

• • Посев материала и приготовление препаратов для окраски по Граму производят как указано выше.

Проведение исследования.

1 этап

Микроскопия исследуемого материала.

Бактериоскопия окрашенного материала.

Присланные в лабораторию мазки фиксируют на пламени и окрашивают по Граму, Цилю-Нельсону (для обнаружения микобактерий туберкулёза) или метиленовым синим. Микроскопия окрашенных мазков позволяет предположить наличие тех или иных видов бактерий, вызвавших заболевание глаз.

Мазки, окрашенные по Граму, исследуют на наличие соматических клеток и внутриклеточно и внеклеточно расположенных микроорганизмов. Наличие в препаратах полиморфноядерных нейтрофиллов свидетельствует о бактериальной инфекции, а присутствие мононуклеарных клеток в мазках с конъюнктивы может свидетельствовать о вирусном конъюнктивите.

Окраска препаратов по Гимза проводится для выявления хламидий и внутриплазматических включений

Бактериоскопию нативного материала проводят при подозрении на кандидоз методом «раздавленной капли».

Результаты бактериоскопии могут быть сообщены врачу в виде предварительного ответа. Дальнейший ход исследования в ряде случаев определяется видом предполагаемых возбудителей.

Посев исследуемого материала.

2 этап

Питательные среды:

1. 5% кровяной агар,

2. шоколадный агар,

3. среда для контроля стерильности.

Первичные посевы на жидких питательных средах, присланные лабораторию помещают в термостат при 37°С. Материал, взятый тампоном, с обильным гнойным отделяемым засевают на чашки с 5% кровяным агаром и среду для контроля стерильности. Термостатирование проводится при 37°С в присутствии СО₂

3 этап

На второй день при появлении роста в бульоне изучают характер роста и проводят бактериологическое исследование с окраской по Граму. В зависимости от морфологии микроорганизмов делаются высевы на элективные питательные среды для выделения чистых культур с последующей идентификацией и определением чувствительности, при наличии роста на 5% кровяном агаре изучают тинкториальные свойства выросших колоний; морфологию бактериоскопическим методом с окраской по Граму. Проводят качественную и количественную оценку бактериального роста (единичные колонии, умеренный, обильный рост). Производят отсев отдельных колоний на элективные среды с целью их идентификации и определения чувствительности. При отсутствии роста в первые сутки посевы оставляют в термостате, ежедневно просматривают их. При обнаружении роста делают соответствующие отсевы. Окончательный ответ об отсутствии роста выдают через трое суток.