2. Определение подлинности органических лекарственных веществ.

Число органических лекарственных веществ, применяемых в современной фармакотерапии, несравнимо больше по сравнению с неорганическими. Учитывая также сложность структуры, следует сказать, что испытание на подлинность органических лекарственных веществ значительно сложнее, чем аналогичные испытания неорганических лекарственных веществ. Единый подход к испытанию на подлинность органических лекарственных веществ может быть разработан только к отдельным группам. Для сложных органических веществ нельзя достичь специфичности с помощью реакций осаждения или образования окрашенных продуктов, которые, как правило, характерны для близких по структуре веществ. Например, амины ароматические, амины алифатические, азотистые основания и др. Поэтому при идентификации органических лекарственных веществ, наряду с химическими реакциями, проводятся определение физико-химических констант: температуры плавления, плотности, вязкости, удельного вращения, величины удельного показателя поглощения, удельной рефракции и др.

Углеводороды. Углеводороды алифатического ряда (парафины) идентифицируют только по физическим характеристикам: плотности, вязкости, температуре плавления (текучести). Из ароматических углеводородов применяется вазелиновое масло, вазелин и парафин, которые различаются по указанным характеристикам.

Ароматические углеводороды, в частности бензол, толуол и ксилол, отличаются от парафинов тем, что имеют характерный запах. Все они нерастворимы в воде, различаются по плотности и могут давать некоторые реакции.

Бензол можно идентифицировать по реакции нитрования. 5 капель бензола нагревают в пробирке со смесью концентрированных серной и азотной кислот. После охлаждения смесь выливают в холодную воду, в смеси появляется белая муть и ощущается запах горького миндаля.

Все ароматические углеводороды дают положительную реакцию с формальдегидсерной кислотой. Около 30 мг углеводорода растворяют в 1 мл четыреххлористого углерода. 1 каплю этого раствора переносят в свежеприготовленный раствор смеси формальдегида с серной кислотой (1 капля 40% формальдегида с 1 мл концентрированной серной кислоты). При встряхивании образуется различное окрашивание для разных углеводородов. Бензол и толуол дают красное или красно-коричневое окрашивание, нафталин образует голубовато-зеленое окрашивание, фенантрен – зеленое, антрацен – желто-зеленое.

Спирты. Из алифатических спиртов широко применяется этанол в качестве экстрагента и растворителя в лекарственных средствах. Метанол применяется в качестве растворителя ( его применение ограничено из-за высокой токсичности).

Для определения подлинности метанола его вначале окисляют с помощью калия перманганата до формальдегида, который дает реакцию с хромотроповой кислотой в концентрированной серной кислоте с образованием фиолетового окрашивания.

5CH₃OH +2KMnO₄+ 3H₂SO₄ → 5 CH₂O + 2MnSO₄ + K₂SO₄ +8H₂O

метиловый формальдегид

спирт

Для испытания на подлинность этанола и для многих алифатических спиртов используется реакция этерификации. Для проведения реакции добавляют к 2 мл этанола, 1 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл концентрированной уксусной кислоты – появляется типичный фруктовый запах этилацетата.

CH₃COONa + C₂H₅OH + H₂SO₄ = CH₃COOC₂H₅ + NaHSO₄ + H₂O

Реакцией, позволяющей отличить этанол от метанола, является йодоформенная проба. В щелочной среде этанол вступает в реакцию с йодом с образованием йодоформа – осадка желтого цвета с характерным запахом.

C₂H₅OH + 4I₂ + 6NaOH → CHI₃ ↓ +HCOONa + 5NaI + 5H₂O

йодоформ

Из высших жирных спиртов в качестве вспомогательных веществ используются цетиловый, цетилстеариловый спирты. Реакций идентификации для них не приводится, поэтому они характеризуются по температуре плавления.

Гликоли.

Пропиленгликоль. По внешнему виду это сиропообразная бесцветная жидкость, легко растворяется в воде и этаноле, ацетоне, растворяется в эфире. Практически не растворяется в минеральных кислотах и жирных маслах. Для подтверждения подлинности пропиленгликоля используется реакция с меди сульфатом в слабощелочной среде. При встряхивании смеси образуется синий раствор.

П оликонденсированные гликоли. Полиэтиленгликоль 400 и 1500. Основной реакцией на полиэтиленгликоли является реакция образования диоксана. При нагревании полиэтиленгликолей с концентрированной серной кислотой образуется диоксан, который является летучим и при пропускании его паров через пробирку с 0,1% раствором ртути хлорида образуется осадок.

Глицерин. Глицерин – сиропообразная жидкость, растворяется в воде и спирте, не растворяется в эфире, хлороформе, в маслах.

Первая реакция с меди сульфатом такая же, как и для пропиленгликоля.

Вторая реакция проводится при нагревании с натрия или калия гидросульфатом – появляется акролеин с характерным запахом.

Многоатомные спирты. Манит, сорбит.

Все многоатомные спирты дают положительную реакцию с меди сульфатом в слабощелочной среде. Многоатомные спирты не восстанавливают реактив Фелинга. Однако, после их окисления раствором калия перманганата в щелочной среде в растворе появляется смесь гексоз, которые восстанавливают реактив Фелинга до Сu₂O.

Многоатомные спирты в частности манит и сорбит повышают степень диссоциации борной кислоты, которая в их присутствии изменяет цвет метилового оранжевого от желтого до оранжево-красного.

Альдегиды. Все типичные реакции для альдегидов можно рассматривать на примере формальдегида. Реакция восстановления серебра до металлического – реакция «серебряного зеркала». К аммиачному раствору серебра нитрата добавляют несколько капель раствора формальдегида и нагревают – на стенках пробирки появляется налет металлического серебра.

2Ag(NH₃)₂NO₃ + HCOH + H₂O 2Ag + HCOONH₄ +2 NH₄NO₃ + NH₃

С реактивом Фелинга при нагревании образуется коричневый осадок оксида меди(I).

Для формальдегида характерна реакция с производными фенола. Формальдегид в присутствии концентрированной серной кислоты (реактив Марки) образует ауриновые красители, имеющие цвет от пурпурно-красного до фиолетового.

Реакция с хромотроповой кислотой рассмотрена при определении метанола.

Кетоны. Подлинность кетонов определяется по наличию карбонильной группы. Эта группа может давать продукты конденсации с гидроксиламином (оксимы) или фенилгидразином (фенилгидразоны). Примером кетонов является камфора. С дифенилгидразином камфора образует динитрофенилгидразон, имеющий характерную температуру плавления (173-175⁰С для природной камфоры и 163-165⁰СС для синтетической камфоры).

Оксимы также имеют характерную температуру плавления.

Сахариды. Среди сахаридов различают моносахариды, дисахариды и полисахариды.

Для моносахаридов общей является реакция окисления. Наиболее часто используют реактив Фелинга (уравнение реакции рассмотрено выше). В результате реакции образуется коричневый осадок оксида меди(I).

С производными гидразина (в частности с фенилгидразином) образуются озазоны, мало растворимые в воде и пригодные для определения температуры плавления.

Моносахариды дают положительную реакцию с α-нафтолом (реакция Молиша). Реакция заключается в том, что моносахариды в присутствии серной кислоты при нагревании образуют производные фурфурола, которые с α-нафтолом в присутствии серной кислоты образуют окрашенные продукты конденсации. Если к смеси раствора моносахарида добавлять осторожно концентрированную серную кислоту, то на границе двух слоев образуется красное или синее окрашивание ( чаще всего красно-фиолетовое).

Реакция с солями тетразолия характерна не только для моносахаридов, но и для всех легко окисляющихся веществ. При нагревании соли тетразолия с моносахаридами в щелочной среде возникает красное, красно-фиолетовое или синее окрашивание, а затем постепенно появляется осадок.

трифенилтетразолия хлорид трифенилформазан

(бесцетный) (красный)

Кроме того, для каждого моносахарида важной характеристикой подлинности является удельное вращение.

Дисахариды. Из дисахаридов широко используют в фармацевтической практике сахарозу и лактозу.

Сахароза не восстанавливает реактив Фелинга. Подлинность ее определяют по величине удельного вращения (66,25- 66,75⁰).

Лактоза восстанавливает реактив Фелинга (отличие от сахарозы). Удельное вращение +52,25 до +52,75⁰.

Полисахариды. Из полисахаридов следует остановиться на декстринах и крахмале.

Декстран выпускается в виде растворов для инфузий. Это обычно бесцветные (допускается слабо желтый цвет), вязкие растворы. Для подтверждения подлинности декстрана смешивают равные объемы растворов декстрана и этанола. При встряхивании постепенно появляется гелеобразный осадок.

После кипячения раствора декстрана с тремя каплями разведенной хлористоводородной кислоты образуется глюкоза, которая обнаруживается с реактивом Фелинга. В отличие декстрана от крахмала и декстрина используется реакция с раствором йода, которая в данном случае отрицательна. Декстрин дает положительную реакцию с раствором йода - фиолетово-красное окрашивание.

Крахмал широко используется как вспомогательное вещество. Он нерастворим в воде, при нагревании с водой образует гель. Гель крахмала с раствором йода образует синее окрашивание.

Карбоновые кислоты

Из общих реакций на карбоновые кислоты следует назвать реакции с ионами металлов, с которыми кислоты образуют окрашенные соединения или осадки. Чаще всего карбоновые кислоты определяются с помощью характерных для них реакций.

Уксусная кислота. После добавления к раствору уксусной кислоты раствора фенолфталеина смесь остается бесцветной. К ней по каплям добавляют раствор щелочи – смесь приобретает малиновое окрашивание, которое исчезает при добавлении нескольких капель раствора уксусной кислоты. Если к этой смеси добавить несколько капель железа(III) хлорида, то возникает красно-коричневое окрашивание.

9CH₃COONa+3FeCI₃+2H₂OFe₃(OH)₂(CH₃COO)₆⁺CH₃COO^- + 2CH₃COOH + 9NaCI

основной ацетат железа

красного цвета

Уксусная кислота в присутствии серной кислоты образует с этанолом этилацетат с характерным запахом.

СН₃СООН + С₂Н₅ОН  СН₃СООС₂Н₅  + Н₂О

уксусно-этиловый

эфир

Молочная кислота. При окислении молочной кислоты с помощью калия перманганата в кислой среде образуется ацетальдегид с характерным запахом.

Молочная кислота дает положительную йодоформенную пробу. Реакция проводится также как и с этанолом.

Яблочная кислота. С раствором кобальта нитрата в присутствии щелочи яблочная кислота образует темно-синее окрашивание.

Винная кислота. Подлинность винной кислоты можно доказать с раствором соли калия как было показано ранее.

С раствором винной кислоты вода известковая дает осадок на холоду ( отличие от лимонной кислоты).

Лимонная кислота. Раствор лимонной кислоты после добавления воды известковой до щелочной реакции на холоду остается прозрачным. При нагревании появляется белый осадок.

Глюкуроновая кислота. Кислота глюкуроновая с раствором железа(III) хлорида дает желто-зеленое окрашивание.

В некоторых фармакопеях приводится реакция с фенилгидразином.При нагревании глюкуроновой кислоты с фенилгидразином в присутствии серной кислоты образуется фенилгидразид, пригодный для определения температуры плавления.

Ароматические кислоты

Б ензойная кислота. Для доказательства подлинности бензойной кислоты вначале ее растворяют в растворе натрия гидроксида, но так, чтобы остался небольшой избыток нерастворившейся кислоты. После фильтрования к фильтрату добавляют несколько капель раствора железа(III) хлорида – выпадает в осадок основной бензоат железа желтовато-розового цвета.

Бензойная кислота способна сублимироваться. Обычно на дно пробирки помещают несколько кристалликов бензойной кислоты и осторожно нагревают. На холодных стенках пробирки появляется белый налет. Для получения хорошего результата стенки пробирки можно обернуть мокрой марлей.

С алициловая кислота является фенолокислотой и поэтому дает положительную реакцию с железа(III) хлоридом с образованием фиолетового окрашивания. Так как кислота плохо растворяется в воде, ее лучше растворить в этаноле и добавить половинное количество воды очищенной.

Салициловая кислота как производное фенола дает реакцию образования ауринового красителя пурпурно-красного цвета.

Ацетилсалициловая кислота дает все реакции на салициловую кислоту. Кроме того, остаток уксусной кислоты обнаруживают по образованию этилацетата.

Некоторые групповые реакции на функциональные группы.

Аминогруппа алифатическая. Эта группа наиболее характерна для алифатических аминокислот. Для ее обнаружения используют реакцию с нингидрином. Ход реакции можно интерпретировать следующим образом: при нагревании аминокислота декарбоксилируется, подвергается окислительному дезаминированию, в результате которого образуются аммиак альдегид и часть восстановленного нингидрина. Аммиак реагирует с нингидрином и восстановленным нингидрином и образует окрашенный в синий цвет продукт.

Несмотря на то, что во всех случаях появляется синее окрашивание, методом тонкослойной хроматографии показано, что во всех случаях получаются разные продукты.

Аминогруппа ароматическая. Эта группа содержится в некоторых местных анестетиках, в большинстве сульфаниламидных препаратов. Для ее обнаружения используют реакцию образования азокрасителя. Реакция проводится в две стадии. Вначале получают соль диазония при добавлении к ароматическому амину раствора нитрита натрия, калия бромида и хлористоводородной кислоты. При этом образуется нуклеофильный заместитель – бромистый нитрозил, который вступает в реакцию с ароматическим амином и образует соль диазония.

N aNO₂ + KBr + 2 HCI→ Br ─N=O + KCI + NaCI + H₂O

Полученную соль диазония по каплям добавляют к щелочному раствору

β- нафтола. В зависимости от строения ароматического амина появляется оранжевое, красное или даже красно-фиолетовое окрашивание.

Стероиды. Под этим понятием объединяются вещества природного происхождения, в основе которых лежит структура стерана или циклопентанпергидрофенантрена.

Это липофильные вещества, растворимые в органических растворителях и нерастворимые в воде. Все они должны быть оптически активными и иметь характерное светопоглощение в УФ- и ИК- области спектра. До сих пор остаются важными для подтверждения подлинности стероидов физические методы и хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента.

Стеролы. Это стероидные соединения, которые содержат гидроксигруппу в положении 3, а также метильные группы в положении 10 и 13 и непредельные связи в положениях 2,4 или 3,5.

Общими реакциями для стеролов являются реакции Сальковского и Либермана – Бурхарда.

По реакции Сальковского к раствору стерола в 2 мл хлороформа добавляют 3-5 мл концентрированной серной кислоты. Хлороформный слой приобретает красный цвет, а слой серной кислоты дает зеленую флуоресценцию.

По реакции Либермана – Бухарда примерно 1 мг субстанции растворяют в 5 мл хлороформа, добавляют 3 капли уксусного ангидрида, 3 капли концентрированной серной кислоты и встряхивают. Считают, что в результате реакции Либермана – Бухарда через последовательные превращения образуется продукт конденсации стерола и образуется карбониевая соль.

Реакции с полинитросоединениями. Эти реакции имеют одинаковый механизм и проводятся с динитро- и тринитропроизводными бензола. Положительную реакцию дают все вещества, имеющие активную метиленовую группу. В щелочной среде полинитросоединения образуют интенсивно окрашенные продукты.

Эту реакцию дают карденолиды, буфадиенолиды, ацетон, 17-кетостероиды и др.

Р еакция Витали-Морена. Реакцию используют как специфическую для некоторых тропановых алкалоидов. При действии азотной кислоты на тропановые алкалоиды образуются производные 4-нитротроповой кислоты, которые под действием щелочи дают окрашенный в фиолетовый цвет мезомерный анион.

М урексидная проба. Реакция используется для подтверждения подлинности производных пурина. К субстанции добавляют пероксид водорода, разведенную хлористоводородную кислоту и выпаривают смесь на водяной бане досуха. К желтовато-красноватому остатку добавляют раствор аммиака – появляется красно-фиолетовое ( пурпурное) окрашивание.

Реакция Ван-Урка.

Эта реакция была предложена для открытия алкалоидов спорыньи. При

взаимодействии производных индола с 4-диметиламинобензальдегидом и железа(III) хлоридом в качестве окислителя в серной кислоте. В результате реакции образуются продукты конденсации голубого цвета.

Таллейохинная реакция. Эту реакцию используют для идентификации хинных алкалоидов, у которых в ядре хинолина имеется атом кислорода.

По новым исследованиям возникающий в результате зеленый продукт является смесью красного производного хинолона и синего продукта неустановленной структуры.

Реакция Легаля. В качестве реактива в этой реакции используют натрия нитропруссид. Реакция Легаля может быть использована для качественного определения ацетона. Она не является специфичной, т.е. ее могут давать метилкетоны, карденолиды, лактаты и другие вещества, способные давать в результате превращений вещества близкие по структуре к ацетальдегиду или метилкетонам.

CH₃COCH₃+Na₂Fe(CN)₅NO+2NaOH  Na₄Fe(CN)₅ON=CHCOCH₃ + H₂O

Реакция Сакагучи. Эта реакция используется для определения остатке гуанидина. Для проведения этой реакции используют α-нафтол (или другой фенол) и, в качестве окислителя, гипохлорид или гипобромид. В щелочной среде возникает красное (красно-фиолетовое) окрашивание.