7. Ди­аг­но­сти­че­ские им­му­но­пре­па­ра­ты.

Вак­цин­ные и сы­во­ро­точ­ные пре­па­ра­ты мо­гут быть не толь­ко ле­чеб­ны­ми и про­фи­лак­ти­че­ски­ми, но и ди­аг­но­сти­че­ски­ми. Из мик­ро­ор­га­низ­мов, их ком­по­нен­тов или син­те­ти­че­ских ана­ло­гов мик­роб­ных ан­ти­ге­нов го­то­вят д и а г н о с т и к у м ы, ан­ти­ген­ные пре­па­ра­ты для се­ро­ло­ги­че­ской ди­аг­но­сти­ки. Ди­аг­но­сти­ку­мы мо­гут быть на­тив­ны­ми и эрит­ро­ци­тар­ны­ми. По­след­ние со­дер­жат ан­ти­ге­ны, фик­си­ро­ван­ные на эрит­ро­ци­тах, и при­ме­ня­ют­ся для по­ста­нов­ки РНГА. В ИФА час­то ис­поль­зу­ют син­те­ти­че­ские или ген­но-ин­же­нер­ные ан­ти­ге­ны-ди­аг­но­сти­ку­мы.

Д и а г н о с т и ч е с к и е с ы в о р о т к и при­ме­ня­ют­ся для иден­ти­фи­ка­ции мик­ро­ор­га­низ­мов и вы­яв­ле­ния мик­роб­ных ан­ти­ге­нов в ор­га­низ­ме при экс­пресс-ди­аг­но­сти­ке. Ди­аг­но­сти­че­ские сы­во­рот­ки мо­гут быть груп­по­вы­ми, ви­дос­пе­ци­фи­че­ски­ми и ва­рос­пе­ци­фи­че­ски­ми. Их по­лу­ча­ют пу­тем им­му­ни­за­ции жи­вот­ных ан­ти­ге­на­ми с по­сле­дую­щей кон­цен­тра­ци­ей, очи­ст­кой от бал­ла­ст­ных при­ме­сей и пе­ре­кре­ст­но реа­ги­рую­щих ан­ти­тел (ис­то­ще­ни­ем сы­во­ро­ток по Кас­тел­ла­ни пу­тем ад­сорб­ции ан­ти­тел на мик­ро­ор­га­низ­мах дру­го­го ви­да или се­ро­ва­ра). Та­кие сы­во­рот­ки на­зы­ва­ют ад­сор­би­ро­ван­ны­ми и мо­но­спе­ци­фи­че­ски­ми.

Ди­аг­но­сти­че­ские сы­во­рот­ки мо­гут быть так­же конъ­ю­ги­ро­ван­ны­ми с мет­кой. Го­то­вят лю­ми­нес­ци­рую­щие сы­во­рот­ки для по­ста­нов­ки РИФ, а так­же свя­зан­ные с фер­мен­том для ИФА. Ме­че­ные сы­во­рот­ки мо­гут быть спе­ци­фич­ны­ми по от­но­ше­нию к ан­ти­ге­ну - для пря­мо­го оп­ре­де­ле­ния ан­ти­ге­на, ли­бо спе­ци­фич­ны­ми по от­но­ше­нию к ви­до­во­му бел­ку ди­аг­но­сти­че­ской сы­во­рот­ки - для не­пря­мых РИФ и ИФА.

Ан­ти­тель­ные эрит­ро­ци­тар­ные ди­аг­но­сти­ку­мы - пре­па­ра­ты из эрит­ро­ци­тов, на ко­то­рых фик­си­ро­ва­ны ан­ти­те­ла. Их ис­поль­зу­ют для вы­яв­ле­ния ан­ти­ге­нов в РОН­ГА - ре­ак­ции об­рат­ной не­пря­мой ге­магг­лю­ти­на­ции.

Наи­бо­лее спе­ци­фич­ны ди­аг­но­сти­че­ские ан­ти­тель­ные пре­па­ра­ты из мо­но­кло­наль­ных ан­ти­тел (МКА).

8. Моноклональные антитела

До середины 1970 г. Единственным способом получения больших количеств специфических антител была иммунизация животных как можно более очищенным антигеном. Но такой антиген все еще содержал много эпитопов. Следовательно, антитела в таких сыворотках были поликлональными антителами, с различными антителами, выработанными на каждый эпитоп. Высоко специфичные сыворотки могли бы быть получены из поликлональных антител дотошным удалением нежелательных антител. Это достигалось путем многократного смешивания цельной иммунной сыворотки с антигенами, содержащими нежелательные эпитопы. Однако, этот процесс (реакция истощения по Кастеллани) не мог гарантировать полного удаления всех нежелательных (перекрестно реагирующих) антител.

В настоящее время моноклональные антитела продуцируются изолированным клоном генетически идентичных клеток, происходящих из единственной стимулированной антитело-образующей клетки. Они могут быть получены в большом количестве, используя специальные клетки, называемые гибридомой. Г.Кёлер и Ц.Мильштейн разработали этот метод в 1975 году в Кембридже, (Англия). В 1984 они были удостоены за это исследование Нобелевской премии.

В-лимфоциты, продуцирующие антитела, подобно любым другим клеткам могут стать злокачественными. Миеломная болезнь - рак, или беспрепятственная пролиферация анителообразующих клеток. Поскольку миелома начинается из единственной клетки, все ее потомство представляет собой клон идентичных лимфоцитов. Антитела, продуцируемые этими лимфоцитами - гомогенные, потому что выработаны отдельным гомогенным клоном клеток. Такие антитела - моноклональные антитела. К сожалению, моноклональное антитело, продуцируемые миеломными клетками специфичны в отношении обычно неизвестного антигена, потому что развитие миеломы случайно.

Было невозможным индуцировать миелому, специфичную для определенного антигена, пока Kёлер и Мильштейн не нашли решение этой проблемы. Они разработали способ объединения миеломной клетки с нормальной иммунной клеткой селезенки, предетерминированной к синтезу определенного антитела. При этом, они получали «гибридную» клетку, которая обладала свойствами обоих типов клетки. Они достигли этого, гибридизируя миеломную клетку с антителообразующими клетками селезенки иммунизированной мыши. В результате получали искуственно созданную клетку, названную гибридомой, которая является по существу антителообразующей фабрикой. В таких клетках вклад миеломной клетки обеспечивает «бессмертие» (неограниченная быстрая пролиферация) и таким образом производство большого количества моноклональных антител; вклад иммунного лимфоцита обеспечивает информацию для специфичности антитела.

Техника создания гибридомных клеток и моноклональных антител показана на рис. 1. По этой методике мыши иммунизируются обычным способом вакциной, которая содержит специфический антиген, против которого требуется получить специфически антитела. Для этого не требуется использовать специально очищенный антиген, содержащий только нужный эпитоп. Каждый из эпитопов антигена стимулирует специфический клон В-лимфоцитов. Таким образом, один антиген может стимулировать множество специфических клонов B-клеток. Селезенку удаляют, и суспензию клеток селезенки смешивают с суспензией миеломных клеток мыши. К смеси добавляют полиэтиленгликоль, который обеспечивает соединение лимфоцитов с миеломными клетками, чтобы стать гибридомой. Каждая гибридомная клетка пролиферирует и дает массивный клон клеток, каждая из которых продуцирует специфическое антитело.

Затем гибридомные клетки переносят по отдельности в индивидуальные лунки пластиковых планшетов и инкубируют для размножения и накопления клонов. Каждый гибридомный клон может производить моноклональное антитело; антитела в каждой лунке тестируются для определения, какая именно гибридома продуцирует нужное антитело (первоначальный антиген не должен быть высоко очищенным). Как только специфическая гибридома идентифицирована, она может быть реклонирована в культуре клеток либо путем введения в перитонеальную полость животных. Клеточная культура образует приблизительно 100 мкг моноклональных антител в 1 милилитре культуральной жидкости; в культуре in vivo продуцируется примерно 100 мкг и больше моноклональных антител в 1 мл перитонеальной жидкости.

Моноклональные антитела имеют значение потому, что они гомогенны, высоко специфичны и могут получаться в больших количествах. Они связываются с одним и только одним антигеном, поэтому моноспецифичны.

Моноклональные антитела стали очень важным инструментом биомедицинских исследований; в 1981, например, они позволили исследователям определить клеток иммунной системы, которые поражались вирусом СПИДа.

Моноклональные антитела становятся также все более и более важными в диагностической и терапевтической медицине. Предлагается использование моноклональных антител для лечения рака человека, моноклональные антитела экспериментально используются для уничтожения клеток опухоли. Моноклональные антитела могут быть помечены радиоактивными изотопами, чтобы определять локализацию опухоли и доставлять смертельные дозы радиации к недоступным опухолям, в то время как нормальные клетки остаются нетронутыми.

Моноклональные антитела могут также использоваться, чтобы таким же образом доставлять противораковые средства к опухолевым клеткам.

Налажено коммерческое производство диагностических наборов с использованием специфических моноклональных антител для диагностики аллергических болезней. Также моноклональные антитела стали чрезвычайно полезными в дифференциации бесчисленных видов и вариантов микроорганизмов.

Кёлер и Мильштейн никогда не патентовали свое открытие! А стоимость коммерчески произведенных моноклональных антител составляет теперь ежегодно миллионы долларов.

В настоящее время моноклональные антитела все чаще используются в диагностической практике в иммуноферментом и иммунофлюоресцентном анализе. При­ме­не­ние моноклональных антител су­ще­ст­вен­но по­вы­ша­ет точ­ность ди­аг­но­сти­ки ин­фек­ци­он­ных и не­ин­фек­ци­он­ных за­бо­ле­ва­ний, по­это­му бу­ду­щее - за са­мым ши­ро­ким ис­поль­зо­ва­ни­ем мо­но­кло­наль­ных ан­ти­тел.

РЕКОМЕНДОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Протченко П.З. Загальна мікробіологія, вірусологія та імунологія. Вибрані лекції: Навч. посібник . – Одеса: Одес. Держ. мед. ун-т, 2002. – 298 с.

2. Пятк³н К. Д., Кривоше¿н Ю.С. М³кроб³олог³я. - К : Высшая школа, 1992. - 432 с.

Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. - М : Медицина, 1983. - 312 с.

3. Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / под ред. Борисова Л.Б. – Г. : Медицина, 1993. – 232 с.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник под ред. А.А.Воробьева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 691 с.

5. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология /ред. Л.Б. Борисов, А.М. Смирнова. - М: Медицина, 1994. - 528 c.

Лекция   2. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КЛАССИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ. Морфология бактерий