3. Новые подходы к созданию вакцин

Применение генетических, биохимических, и иммунологических принципов к конструированию новых вакцин открывает перспективу успешной иммунизации против ряда заболеваний, проблема защиты против которых до сих пор не была решена. Современные методы исследования - использование рекомбинантной ДНК, химический синтез вакцин, использование антиидиотипических антител. Эти методы уже дали экспериментальную базу для создания иммунитета против малярии, трипаносомоза и гепатита B.

Рекомбинантные вакцины. Несомненно, наиболее важные подходы к созданию новых вакцин находятся в области рекомбинантной технологии.

Метод основан на том, что геномная ДНК практически из любого источника, содержащая структурные гены для нужных антигенов, может быть встроена в плазмидные или вирусные векторы. Инфекция бактерий, дрожжей или клеток млекопитающих соответствующим вектором сопровождается экспрессией ДНК в форме продукта ее гена (антигена). Таким образом, в результате культивирования клеток можно получить большое количество нужных антигенов.

Вирус вакцины - удобный проводник для экзогенной ДНК, потому что он имеет большой ДНК-овый геном, и депротеинизированная ДНК этого вируса неинфекционна. С ним можно безопасно работать в лабораторных условиях он обладает способностью к транскрибированию собственного генома, репродуцируется в большей степени в цитоплазме, чем в ядре, где вирус могут бы более легко изменять клетку хозяина. Широкое использование вируса вакцины на протяжении почти 200 лет для профилактики натуральной оспы создало основу для восприятия вируса вакцины в качестве средства для иммунизации населения..

Порядок работы по получению рекомбинантной вакцины может меняться в зависимости от вектора и лабораторных условий. Обычно одним из первых шагов должна быть очистка ДНК вируса вакцины, содержащей геном для антигена (например, для поверхностного антигена вируса гепатита В - HBsAg), который был предварительно расщеплен эндонуклеазой и сшит с ДНК вируса вакцины. Процесс сшивания выполняется так, чтобы каждый конец Это выполнено так, чтобы каждый конец гена для HBsAg был связан с ДНК вирусы вакцины. Такой комплекс (ДНК вакцины-ДНК HBs антигена - ДНК вакцины) встраивается в плазмидный вектор с помощью расщепления и сшивания эндонуклеазой. Затем вся эта конструкция используется для заражения линии клеток, которая одновременно инфицируется вирусом вакцины. Когда происходит рекомбинация между вирусом вакцины и такой составной ДНК, ген для HBsAg встраивается в вирус вакцины. Рекомбинанты необходимо селекционировать, отобрать по признаку секреции HBsAg из вторичной культуры клеток, инфицированной вирусом вакцины, выделенным из первичной культуры клеток. В результате получают мелкие частицы 22 нанометра в диаметре, идентичные поверхностному антигену вируса гепатита В в крови носителей вируса гепатита В. Кролики, иммунизированные полученным вирусом вакцины продуцировали антитела в титрах, в 10 и более раз превышающих уровень антител, считающийся защитным для человека. Это указывает на то, что рекомбинантный вирус вакцины обеспечивает синтез и секрецию HBsAg параллельно с инфекцией вирусом вакцины.

Этот метод был использован также для гликопротеида D вируса простого герпеса, а также гриппозных вакцин. Поскольку в вирус осповакцины можно включить до 25000 пар оснований дополнительно, а последовательности для антигенов - часто меньше 1000 пар основапний, вирус вакцины может использоваться как поливалентная вакцина, несущая антигены для многих различных патогенных микроорганизмов.

Синтетические вакцины. Второй подход к конструированию новых вакцин основан на пептидном синтезе. В результате исследования последовательности ДНК, матричной РНК или непосредственно первичной структуры белка может быть определена полная структура антигена. Не всегда необходимо знать полную аминокислотную последовательность, так как существенные эпитопы антигена могут быть определены иммунологическими методами, но как только эти эпитопы идентифицированы, используется пептидный синтез для наработки этих антигенных детерминант.

Получен синтетический декапептид вируса гепатита В. Пассивная иммунизация экспериментально приготовленной антисывороткой к этому синтетическому пептиду создавала частичную защиту шимпанзе к вирусной инфекции.

Токсин дифтерии (молекулярная масса 62000) - другой антиген, который изучался от точки зрения получения синтетической вакцины. Полная аминокислотная последовательность токсина известна и определена, как имеющая две Цис-Цис петли. Одна из этих петель соединяет остатки от 188 до 201. Гексадекапептид (16) из аминокислот от 186 до 201 был связан с белковым носителем и использован для иммунизации морских свинок. Антитела полученной иммунной сыворотки связывали нативный токсин и нейтрализовали его деромонекротическую и летальную активность для морских свинок. Это - достаточное основание перспективности такой вакцины.

Белки спорозоитов малярийного плазмодия - показательный пример того, насколько эффективной может быть синтетическая вакцина. белки находятся на наружной поверхности спорозоитов в той стадии развития, в которой возбудитель малярии проникает в организм человека при укусе комара. Plasmodium vivax, Plasmopium falciparum, Plasmodium malariae и вероятно другие виды плазмодиев, содержат близкие по структуре, если не идентичные спорозоитные белки.

Антисыворотка со способностью нейтрализовать инвазионную способность спорозоитов вызывает высвобождение спорозоитного белка с поверхности паразита, что подтверждает решающую роль этого белка в противомалярийном иммунитете. Моноклональные антитела, специфичные для спорозоитного белка позволили установить, что этот белок имеет высокую молекулярную массу (42000), но содержит единственный эпитоп, повторяющийся несколько раз. Аминокислотная последовательность этой детерминанты была определена, она оказалась докапептидом. Димерная форма этого пептида была связана с бычьим гамма-глобулином или гемоцианином в качестве полноценного носителя и использована для иммунизации кроликов. Добавление антидимерной сыворотки к спорозоитам предотвращало их инвазионную способность для обезьян.

Одним из недостатков синтетических пептидных вакцин остается то, что часто они содержат только один эпитоп и являются, таким образом, гаптенами. Это требует конструирования неоантигенов, причем необходимо так подобрать молекулу носителя, чтобы не было нежелательной продукции антител у реципиента вакцины.

Мы не обсуждаем новые вакцины, которые пока мало используются на практике, как например, вакцина против СПИДа.

Антиидиотипические вакцины. Как говорилось в лекции № 6 «Биология имунного ответа ", идиотипическая детерминанта иммуноглобулина - та часть вариабельной области, которая содержит антиген-связывающий центр. Каждый идиотип соответствует уникальному эпитопу антигена. Идиотоп распознается как уникальная антигенная часть иммуноглобулина и служит стимулом для формирования антиидиотипических антител в соответствии с теорией иммунологической регуляторной сети Ерне. Таким образом, эпитоп зеркально отражается в идиотопе, который в свою очередь отражается другим идиотопом в анти-идотипическом антителе. Следовательно, анти-идиотип и эпитоп могут рассматриваться как зеркальные отражения идиотипа и, таким образом, подобны друг другу. Является ли это основанием считать, что антиидиотипический иммуноглобулин может выполнять функцию эпитопа в качестве вакцины?

В некоторых случаях - да; антиидиотип может заменять первоначальный антигенный эпитоп. Использованные в качестве «вакцины» антиидиотипические антитела к поверхностному гликопротеиновому антигену возбудителя сонной болезни, Trypanosoma rhodesiense, защищали мышей от заражения паразитом (оригинальным эпитопом). В отдельных исследованиях у мышей, которым вводили антитела против a-антигена вируса гепатита В, после введения анти-идиотипической сыворотки увеличивался ответ на стандартную вакцину гепатита B или пептидную вакцину из этого вируса. В этом примере вирус применялся в качестве подкрепляющего антигена для анти-идиотипической вакцины, эффективность которой подтверждалась косвенно.

Анти-идиотипические вакцины должны быть наиболее полезными, когда первоначальный антиген трудно выделить, содержит токсические компоненты или может реверсировать из аттенуированного состояния к исходному вирулентному виду. Один существенный недостаток - анти-идиотипические сыворотки человеческого происхождения или не были вообще доступны для изучения, или не были достаточно изучены. Анти-идиотипические сыворотки других видов животных имеют период полураспада в организме человека всего лишь одну-две недели, что резко снижает их эффективность. Риск развития сывороточной болезни при введении человеку гетерологичных лечебно-профилактических сывороток очень высок (Мы говорили об этом на лекции № 8 «Аллергия).

Эти недостатки можно устранить использованием человеческих анти-идиотипических антител, полученных из сыворотки человека или же с помощью человеческих гибридом, о которых пойдет речь ниже.

Как видно из сказанного, новые вакцины пока находятся в стадии разработки и не имеют широкого применения в практике. Традиционные вакцины имеют основное значение в профилактике инфекционных заболеваний.

4. ВАК­ЦИ­НО­ПРО­ФИ­ЛАК­ТИ­КА И ВАК­ЦИ­НО­ТЕ­РА­ПИЯ.

Вак­ци­ны при­ме­ня­ют­ся в ос­нов­ном для про­фи­лак­ти­ки ин­фек­ци­он­ных за­бо­ле­ва­ний - вак­ци­но­про­фи­лак­ти­ки. Вы­де­ля­ют п л а н о в у ю вак­ци­но­про­фи­лак­ти­ку - обя­за­тель­ную вак­ци­на­цию дет­ско­го на­се­ле­ния.

Со­глас­но При­ка­зу МЗ Ук­раи­ны от 25.01.96 г. № 14 у нас в стра­не пла­но­вая вак­ци­на­ция про­во­дит­ся против:

1. Ту­бер­ку­ле­за (вак­ци­на БЦЖ) - на 3-5 день жиз­ни ре­бен­ка;

2. По­лио­мие­ли­та (жи­вая эн­те­раль­ная) + кок­лю­ша, диф­те­рии и столб­ня­ка (АКДС) - в 3 ме­ся­ца жиз­ни трех­крат­но с пе­ре­ры­вом в 1 ме­сяц;

3. Ко­ри, па­ро­ти­та, крас­ну­хи (ас­со­ции­ро­ван­ная жи­вая вак­ци­на ли­бо со­от­вет­ст­вую­щие мо­но­вак­ци­ны) - в 12 ме­ся­цев.

4. Кро­ме то­го, этим при­ка­зом оп­ре­де­ля­ет­ся обя­за­тель­ная вак­ци­на­ ция про­тив ге­па­ти­та В, на­чи­ная с 1 ме­ся­ца жиз­ни.

В Великобритании принята примерно такая же схема плановой вакцинации (табл. 2).

Вак­ци­на­ция по эпидемиологическим показаниям про­во­дит­ся в оп­ре­де­лен­ных рай­онах, эн­де­мич­ных по со­от­вет­ст­вую­щим ин­фек­ци­ям (кле­ще­вой эн­це­фа­лит), а так­же для пре­ду­пре­ж­де­ния рас­про­стра­не­ния мас­со­вых эпи­де­мий (грип­поз­ная, хо­лер­ная вак­ци­ны).

В а к ц и н о т е р а п и я - ле­че­ние за­бо­ле­ва­ний с по­мо­щью вак­цин. Обыч­но вак­ци­но­те­ра­пия при­ме­ня­ет­ся при хро­ни­че­ских вя­ло­те­ку­щих за­бо­ле­ва­ни­ях с це­лью сти­му­ли­ро­ва­ния им­мун­ной сис­те­мы ор­га­низ­ма - при го­но­рее, ди­зен­те­рии, бру­цел­ле­зе, ста­фи­ло­кок­ко­вых ин­фек­ци­ях и др.

Ле­чеб­ные вак­ци­ны го­то­вят­ся в про­из­вод­ст­вен­ных ус­ло­ви­ях спе­ци­аль­но для этих це­лей. Обыч­но это инак­ти­ви­ро­ван­ные вак­ци­ны. Из ана­ток­си­нов толь­ко один - стафилококковый ана­ток­син - при­ме­ня­ет­ся для вак­ци­но­те­ра­пии. Раз­но­вид­ность ле­чеб­ной вак­ци­ны - ау­то­вак­ци­на, ко­то­рая

Табл. 2. ГРАФИК ИММУНИЗАЦИИ ДЕТЕЙ В ВЕЛИКОБРИТАНИИ: модель для стран с адекватным здравоохранением

Возраст	Вакцина	Примечания
В течение 1 года жизни	АКДС: дифтерия столбняк коклюш	Начало в 2 месяца; вторая доза в 3 месяца и третья - в 4 месяца внутримышечным или глубоким подкожным введением
	Оральная полиомиелитная	Дается одновременно с вакциной АКДС
В течение 2-го года	Корь Паротит Краснуха	Производится одно введение ассоциированной живой вакцины в возрасте12-18 месяцев
В 4-5 лет	ДС: дифтерия столбняк	Реиммунизация
В 10-14 лет	Краснуха * БЦЖ *	Только для девочек Для туберкулин-отрицательных детей
В 15-18 лет	Столбняк Оральная полиомиелитная	Реиммунизация Реиммунизация

* с интервалом не менее 3 -х недель между ними

при­ме­ня­ет­ся толь­ко для не­го. Ау­то­вак­ци­на час­то ока­зы­ва­ет­ся зна­чи­тель­но эф­фек­тив­нее вак­ци­ны из про­из­вод­ст­вен­ных штам­мов.

Вак­ци­но­те­ра­пия ос­но­вы­ва­ет­ся как на спе­ци­фи­че­ском дей­ст­вии ан­ти­ге­нов воз­бу­ди­те­ля, так и на не­спе­ци­фи­че­ской ак­ти­ва­ции им­мун­ной сис­те­мы ком­по­нен­та­ми вак­ци­ны. При этом важ­но учи­ты­вать, что ре­ак­ция им­мун­ной сис­те­мы на ан­ти­ге­ны воз­бу­ди­те­ля в со­ста­ве вак­ци­ны от­ли­ча­ет­ся от им­мун­но­го от­ве­та на при­сут­ст­вие воз­бу­ди­те­ля в ор­га­низ­ме, что и вы­зы­ва­ет сти­му­ля­цию за­щит­ных ме­ха­низ­мов ор­га­низ­ма. За­ви­сит это как от то­го, что при вак­ци­но­те­ра­пии вво­дит­ся зна­чи­тель­ная до­за антигена в дру­гое ме­сто ор­га­низ­ма, так и от из­ме­не­ния ан­ти­ген­ных свойств ком­по­нен­тов мик­ро­ба при инак­ти­ви­ро­ва­нии его при при­го­тов­ле­нии вак­ци­ны.

5. СЫ­ВО­РО­ТОЧ­НЫЕ ПРЕ­ПА­РА­ТЫ

Сы­во­ро­точ­ные пре­па­ра­ты - это им­мун­ные сы­во­рот­ки и иму­ног­ло­бу­ли­ны из них.

И м м у н н ы е с ы в о р о т к и - сы­во­рот­ки, со­дер­жа­щие боль­шое ко­ли­че­ст­во ан­ти­тел к оп­ре­де­лен­но­му ан­ти­ге­ну. По­лу­ча­ют их пу­тем ги­пе­рим­му­ни­за­ции (мно­го­крат­ной им­му­ни­за­ции по оп­ти­маль­ной схе­ме) жи­вот­ных со­от­вет­ст­вую­щи­ми ан­ти­ге­на­ми.

Для по­лу­че­ния а н т и т о к с и ч е с к и х сы­во­ро­ток жи­вот­ных им­му­ни­зи­ру­ют ана­ток­си­ном, а н т и м и к р о б н ы х - вак­ци­на­ми. Ан­ти­мик­роб­ные сы­во­рот­ки при вве­де­нии до­зи­ру­ют толь­ко по объ­е­му, для оцен­ки ак­тив­но­сти ан­ти­ток­си­че­ских - ис­поль­зу­ют еди­ни­цы ак­тив­но­сти. За 1 ме­ж­ду­на­род­ную еди­ни­цу (МЕ) ан­ти­ток­си­че­ской сы­во­рот­ки при­ни­ма­ют до­зу, ней­тра­ли­зую­щую оп­ре­де­лен­ное чис­ло ДЛМ ток­си­на. Су­ще­ст­ву­ют ме­ж­ду­на­род­ные эта­ло­ны ан­ти­ток­си­нов, по ним тит­ру­ют про­из­вод­ст­вен­ные се­рии сы­во­ро­ток. Для ле­че­ния вво­дят ты­ся­чи МЕ сы­во­ро­ток, на­при­мер, при диф­те­рии - 10 - 100 тыс. МЕ.

И м м у н о г л о б у л и н ы - гам­маг­ло­бу­ли­но­вая фрак­ция сы­во­ро­ток, очи­щен­ная от бел­ков, не об­ла­даю­щих ан­ти­тель­ной ак­тив­но­стью. Им­му­ног­ло­бу­ли­ны (ус­та­рев­шее на­зва­ние - гам­маг­ло­бу­ли­ны) об­ла­да­ют бо­лее вы­со­кой эф­фек­тив­но­стью и мень­шим по­боч­ным, в том чис­ле и сен­си­би­ли­зи­рую­щим, дей­ст­ви­ем, яв­ля­ясь кон­цен­тра­том ан­ти­тел. Име­ют­ся им­му­ног­ло­бу­ли­ны на­прав­лен­но­го дей­ст­вия (про­ти­во­грип­поз­ный, противостафилокковый, ан­ти­ра­би­че­ский и др.), ко­то­рые по­лу­ча­ют из им­мун­ных сы­во­ро­ток, и “им­му­ног­ло­бу­лин че­ло­ве­че­ский нор­маль­ный“, по­лу­чае­мый из до­нор­ской или пла­цен­тар­ной кро­ви. По­след­ний со­дер­жит все те ан­ти­те­ла, ко­то­рые при­сут­ст­ву­ют в кро­ви взрос­ло­го на­се­ле­ния.

Все сы­во­ро­точ­ные пре­па­ра­ты мо­гут быть го­мо­ло­гич­ны­ми (из кро­ви че­ло­ве­ка) и ге­те­ро­ло­гич­ны­ми (из кро­ви жи­вот­ных). Го­мо­ло­гич­ные сы­во­рот­ки и им­му­ног­ло­бу­ли­ны об­ла­да­ют мень­шим сен­си­би­ли­зи­рую­щим дей­ст­ви­ем и доль­ше со­хра­ня­ют­ся в ор­га­низ­ме по­сле вве­де­ния - до ме­ся­ца.

6. СЕ­РО­ТЕ­РА­ПИЯ И СЕ­РО­ПРО­ФИ­ЛАК­ТИ­КА.

Серотерапия. Сы­во­ро­точ­ные пре­па­ра­ты соз­да­ют ис­кус­ст­вен­ный пас­сив­ный им­му­ни­тет, что ис­поль­зу­ет­ся для ле­че­ния и про­фи­лак­ти­ки ря­да за­бо­ле­ва­ний. Л е ч е б н о е при­ме­не­ние име­ют про­ти­во­диф­те­рий­ная, про­ти­во­столб­няч­ная, про­ти­во­бо­ту­ли­ни­че­ские, про­ти­во­ган­гре­ноз­ные, про­ти­во­змеи­ные ге­те­ро­ло­гич­ные сы­во­рот­ки, го­мо­ло­гич­ные про­ти­во­ста­фи­ло­кок­ко­вая плаз­ма и не­ко­то­рые дру­гие. Им­му­ног­ло­бу­ли­ны при­ме­ня­ют пре­иму­ще­ст­вен­но го­мо­ло­гич­ные - противостафилококковый, про­ти­во­грип­поз­ный, ан­ти­ра­би­че­ский и др.

С е р о п р о ф и л а к т и к а - предупреждение заболеваний путем создания искусственного пассивного иммунитета. Серопрофилактику про­во­дят наи­бо­лее час­то им­му­ног­ло­бу­ли­ном че­ло­ве­че­ским нор­маль­ным - для се­ро­про­фи­лак­ти­ки ге­па­ти­та А, ко­ри и др. за­бо­ле­ва­ний. Кро­ме то­го, при­ме­ня­ют им­му­ног­ло­бу­ли­ны про­ти­во­грип­поз­ный и ан­ти­ра­би­че­ский и др.

Противостолбнячная антитоксическая сыворотка из крови лошадей ранее широко применялась для профилактики столбняка при травмах. В настоящее время она применяется реже, так как дает аллергические осложнения. Серопрофилактика газовой анаэробной инфекции введением лошадиной противогангренозной сыворотки проводится и теперь.