7. Другие типы реакций антиген-антитело.

Иммуноблоттинг (вестерн-блот).

Антигенный материал разделяют на индивидуальные компоненты методом электрофореза в полиакриламидном геле. Затем разделенные компоненты переносят электрофоретически на нитроцеллюлозную мембрану. Ее разрезают на полоски (стрипы) и отдельные полоски инкубируют с исследуемой сывороткой. Затем полоску обрабатывают антиглобулиновой сывороткой, меченной ферментом, и, наконец, субстратом (хромогеном). Если в исследуемой сыворотке присутствуют антитела к антигенам, фиксированным на стрипе, появляются окрашенные пятна. Иммуноблоттинг является высокоспецифичным и высокочувствительным методом антигенов и антител, например, он, вероятно, наиболее чувствительный метод для обнаружения антител против ВИЧ при диагностике СПИДА.

Чувствительность обнаружения антигена наиболее высока при использовании радиоактивных меченых реагентов. Иммунологические пробы, использующие радиоактивные компоненты, называются радиоиммуноанализом, или РИА.

РИА - высоко чувствительная реакция, и может использоваться для измерения белковых гормонов, ферментов, компонентов комплемента, вирусных антигенов, а при использовании антисывороток против гаптенов, низкомолекулярных веществ типа антибиотиков, стероидов, тироксина и морфия. Ограничения - стоимость и потенциальная опасность, сопутствующая радиоактивности.

Реакция иммунного лизиса - растворение клеток под действием антител и комплемента. Когда антитело соединяется с антигеном, входящим в поверхностные структуры клеток (некоторые виды грам-отрицательных палочек и эритроцитов) и обеспечено участие комплемента, клетки лизируются, то есть растворяются. Иногда бактерии погибают без лизиса (иммуноцидная реакция).

Реакция опсонизации. Когда антитело соединяется с антигеном на поверхности бактериальных клеток и присутствуют фагоциты, бактерии опсонизируются, то есть становятся более восприимчивыми к фагоцитозу. Существенную роль играет активация комплемента, особенно, если антитела присутствуют в небольшой концентрации.

Имеется много других вариантов серологических реакций, которые реже используются в лабораторной практике. Некоторые из них мы будем изучать в курсе специальной медицинской микробиологии.

8. Применение серологических реакций в диагностике

Серологические реакции применяют для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний. Они могут быть использованы для серологической идентификации, серологической диагностики и для экспресс-индикации возбудителя в организме или во внешней среде.

Серологическая идентификация - определение вида и серовара микроорганизма по его реакциям с диагностическими сыворотками.

Для серологической идентификации применяют самые различные серологические реакции, чаще всего - реакцию агглютинации (РА), реакцию связывания комплемента (РСК) , реакцию нейтрализации (РН), реакцию иммунофлюоресценции (РИФ), реакцию обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА). Точность серологической идентификации в значительной мере зависит от специфичности диагностических сывороток.

Серологическая идентификация требует выделения и накопления микроорганизма в чистой культуре, так как обычно для серологических реакций необходимо достаточное число микробных клеток.

Серологическая диагностика - диагностика заболевания путем выявления в сыворотке больного антител к возбудителю.

Она основана на том, что при заболевании в организме накапливаются антитела к антигенам возбудителя. Антитела являются свидетелем протекающего в настоящий момент либо бывшего ранее заболевания. Серологический диагноз ставится следующим образом: у пациента берут кровь из пальца или из вены, получают из нее сыворотку и определяют в сыворотке содержание антител к определенному антигену. Антигеном может служить диагностикум - препарат из микроорганизмов для серологической диагностики. Это может быть взвесь убитых микроорганизмов, продукты его распада, секретируемые микробом вещества и даже синтетические аналоги микробных антигенов. Для серологической диагностики применяют в настоящее время реакцию агглютинации, РНГА (реакцию непрямой гемагглютинации), РСК, РН, РИФ. Осо­бенно боль­шое зна­че­ние име­ет ис­поль­зо­ва­ние са­мых чув­ст­ви­тель­ных се­ро­ло­ги­че­ских ре­ак­ций - ИФА (им­му­но­фер­мент­но­го ана­ли­за) и РИА (ра­дио­им­мун­но­го ана­ли­за, ко­то­рый в на­стоя­щее вре­мя при­ме­ня­ет­ся ре­же, чем ИФА).

Реально наиболее употребительными реакциями для серодиагностики в настояще время являются две - РНГА и ИФА.

Налажено производство соответствующих эритроцитарных диагностикумов и тест-систем для ИФА-диагностики, что позволяет проводить массовую постановку реакций в стандартных условиях.

Современная аппаратура для ИФА-анализа автоматизирует многие операции и позволяет проводить точную диагностику, поэтому в настоящее время применение ИФА неуклонно расширяется.

Кри­те­рии се­ро­ло­ги­че­ско­го ди­аг­но­за :

1) Об­на­ру­же­ние ан­ти­тел к воз­бу­ди­те­лю в ди­аг­но­сти­че­ском титре;

2) Обнаружение диагностического нарастания титра антител;

3) Обнаружение антител к возбудителю, относящихся к классу IgM.

Диагностический титр - титр антител к возбудителю, который встречается у больных и не встречается у здоровых.

У здоровых лиц всегда обнаруживаются антитела ко многим микроорганизмам, в том числе и к патогенным. Эти антитела могут быть анамнестическими, оставшимися после перенесенного заболевания, прививочными - после вакцинации. Они могут быть антителами к перекрестнореагирующим антигенам других микроорганизмов, часть из них являются естественными антителами. Кроме того, наши диагностикумы не всегда строго специфичны и могут содержать перекрестно реагирующие антигены, что может имитировать присутствие антител к микроорганизмам, с которыми человек никогда не встречался.

Поэтому опытным путем, в результате обследования большого чис­ла здо­ро­вых и боль­ных лиц, ус­та­нов­ле­ны ди­аг­но­сти­че­ские тит­ры для ка­ж­до­го за­бо­ле­ва­ния при ис­поль­зо­ва­нии оп­ре­де­лен­ной се­ро­ло­ги­че­ской ре­ак­ции. На­при­мер, при брюш­ном ти­фе ди­аг­но­сти­че­ский титр ан­ти­тел в ре­ак­ции агг­лю­ти­на­ции со­став­ля­ет 1 : 200.

Однако, не всегда можно ориентироваться только на титр антител, так как в начале заболевания антител может быть еще мало, у некоторых лиц вообще идет слабая выработка антител, раннее использование антибиотиков снижает иммунный ответ организма на антигены возбудителя. Кроме того, у переболевших либо вакцинированных могут сохраняться достаточно высокие титры антител.

Поэтому проводят исследование титров антител в парных сыворотках. Парные сыворотки - сыворотки, взятые у пациента с перерывом в 1 - 3 недели. Их исследуют одновременно и обнаруживают нарастание титров антител, что указывает на текущее в настоящее время заболевание. Диагностическим считается нарастание титров антител в 4 раза и больше.

Наконец, можно и в одной пробе сыворотке дифференцировать повышение титров антител, вызванное заболеванием, от анамнестической и прививочной реакции. Для этого определяют содержание антител к возбудителю, относящихся к IgM. Наиболее достоверно это достигается при использовании ИФА-диагностики. Кроме того, дифференцируют IgM от IgG по чувствительности IgM - антител к 2-меркаптоэтанолу.

Серологическая диагностика является очень важным компонентом диагностики не только инфекционных, но и неинфекционных заболеваний.

Серологические реакции широко используются в настоящее время также для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний путем выявления в организме антигенов возбудителя. Чаще всего для этой цели применяют РИФ, ИФА (иммуноферментный анализ), РОНГА. Экспресс-индикация микроорганизмов может использоваться также в санитарной микробиологии.

РЕКОМЕНДОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Протченко П.З. Загальна мікробіологія, вірусологія та імунологія. Вибрані лекції: Навч. посібник . – Одеса: Одес. Держ. мед. ун-т, 2002. – 298 с.

2. Пятк³н К. Д., Кривоше¿н Ю.С. М³кроб³олог³я. - К : Высшая школа, 1992. - 432 с.

Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. - М : Медицина, 1983. - 312 с.

3. Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / под ред. Борисова Л.Б. – Г. : Медицина, 1993. – 232 с.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник под ред. А.А.Воробьева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 691 с.

5. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология /ред. Л.Б. Борисов, А.М. Смирнова. - М: Медицина, 1994. - 528 c.

Лекция   10. АЛЛЕРГИЯ .