2. Реакция агглютинации.

Реакция агглютинации - склеивание корпускулярного антигена под действием антител.

Как говорилось ранее, реакция преципитации происходит с растворимым антигеном. В реакции агглютинации, напротив, участвуют корпускулярные антигены (эритроциты, бактериальные клетки и др.). Корпускулярные антигены с эпитопами на их поверхности могут быть перекрестно связаны специфическими антителами и формировать большие скопления или агрегаты (рис. 2).

Когда антитела реагируют с эпитопами на соседних антигенах, корпускулярный антиген соединяется в видимые хлопья. При прямой агглютинации (показанной на рисунке) антитело реагирует со свободным корпускулярным антигеном в суспензии.

Рис 2. МЕХАНИЗМ АГГЛЮТИНАЦИИ

Этот процесс называется агглютинацией, антитела, которые участвуют в этом процессе, называют агглютининами, а антиген - агглютиногеном.

Реакция может быть поставлена двумя способами - на стекле и в пробирках.

Реакция агглютинации на стекле - обычно ориентировочная или качественная реакция. Клетки (живые или убитые бактерии, эритроциты) суспендируют в капле солевого раствора на предметном стекле и добавляют небольшую каплю иммунной сыворотки. Предметное стекло слегка покачивают в течение одной-двух минут и отмечают наличие или отсутствие агглютинации. Постановка контроля (суспензия бактерий в физиологическом растворе без добавления сыворотки) необходима для исключения возможной самопроизвольной агглютинации.

Пробирочная реакция. Это - обычно подтверждающая и количественная реакция. К последовательным разведениям антисыворотки в пробирках добавляют стандартное количество суспензии клеток. Пробирки инкубируют и наибольшее разведение иммунной сыворотки, в котором еще наблюдается реакция агглютинации, принимают за титр агглютининов.

Реакция агглютинации значительно осложняется комплексностью антигенной структуры бактерий. Таким образом, неизвестную сыворотку приходится испытывать отдельно со жгутиковыми (Н), и соматическеми (O) антигенами различных бактерий. Наоборот идентификация неизвестного микроорганизма может потребовать ряда иммунных сывороток, каждая из которых специфична к одному известному антигену.

Реакция агглютинации широко используется для идентификации видов Salmonella, Shigella, сероваров Escherichia coli, Neisseria meningitidis и других бактерий.

Среди бактериальных болезней человека, для которых реакция агглютинации имеет диагностическую ценность - брюшной тиф (реакция Видаля), сальмонеллез, бруцеллез (реакция Райта), туляремия, сыпной тиф и другие.

Вариантом прямой реакции агглютинации является непрямая, или пассивная реакция агглютинации (рис. 3).

Рис. 3. СХЕМА РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ

Этот вариант позволяет использовать в реакции агглютинации многие растворимые антигены. В реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) антигены (бактериальные компоненты или вирусные частицы) адсорбируют предварительно на поверхности эритроцитов. Эритроциты с адсорбированным на них антигеном реагируют, как будто они сами обладают специфичностью адсорбированного антигена. На рис. 3 показана пассивная агглютинация с эритроцитами, на которых адсорбирован антиген. Когда специфическое антитело добавляется к эритроцитам с адсорбированным на них антигеном, образуются мостики из антитела между клетками, формируются большие скопления клеток. Они легко заметны невооруженным глазом.

Этот метод более чувствителен чем обычные реакции преципитации и может быть использован для тканевых антигенов, вирусов, анатоксинов и других антигенов, которые трудно исследовать другими методами.

Если к эритроцитам присоединять не антиген, а антитела, становится возможным определять неизвестный антиген с помощью такого антительного диагностикума. Такая реакция называется реакцией обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА).

Реакция латекс-гглютинации похожа на РНГА, но вместо эритроцитов антиген или антитело адсорбируется на частицах латекса.

7.3. Реакция биологической нейтрализации - обезвреживание токсина или микроорганизма антителами (антитоксинами, антимикробными или вируснейтрализующими).

Когда антитело соединяется с токсином, ядовитое действие токсина нейтрализуется. На этом основано применение антитоксических сывороток для лечения болезней, в патогенезе которых принимает участие экзотоксин (дифтерии, столбнякя, ботулизм и др.).

Так как токсин - это растворенный антиген, он также преципитируется (такая реакция называется реакцией флоккуляции).

Токсины и антитоксины могут быть измерены в биологических тестах по гибели животных, кожных пробах на животных и у чиловека (например - проба Шика при дифтерии, проба Дика при скарлатине), реакции нейтрализации на клетках в культуре тканей.

Антитоксины также нейтрализуют любые проявления ядовитого эффекта токсина in vitro: лецитиназа Clostridium perfringens подавляется противогангренозной сывороткой, гемолитическая активность стрептолизина O нейтрализуется антистрептолизином O, который появляется в сыворотке больных, инфицированных большинством штаммов гемолитического стрептококка.

Обезвреживание наступает не всегда. Эндотоксины грам-отрицательных бактерий могут соединяться со специфическими антителами, но оставаться токсическими. Некоторые ферменты могут преципитироваться антителами, но все сохранять свою специфическую каталитическую активность.

7.4. Реакция связывания комплемента.

Комплемент принимает участие во многих иммунологических реакциях и связывается при соединении антигена с антителом. Способность комплексов антиген-антитело адсорбировать комплемент используется в реакции связывания комплемента (РСК). Это универсальная и чувствительная реакция, применимая для различных типов антигенов и антител. РСК - сложная реакция, состоящая из двух этапов и пяти реагентов: антигена, антитела, комплемента, эритроцитов барана и гемолитической сыворотки (сыворотки против эритроцитов барана).

РСК включает две системы: опытную систему, в которой антиген и антитело реагируют в присутствии лимитированного количества комплемента и гемолитическую систему, в который устанавливается, связался ли комплемент, или нет. Так как сыворотка крови человека содержит неодинаковое и неизвестное количество комплемента, все сыворотки, используемые в реакции прогревают (при 56 C в течение 30 минут) для инактивации собственного комплемента сыворотки и добавляют известное количество комплемента (1,25-1,5 титра) в виде свежей или консервированной сыворотки морской свинки.

1. Опытная система. Антиген, антитело и комплемент смешивают и инкубируют в термостате для взаимодействия. Если антиген встречается со специфическим антителом, они взаимодействуют, и комплемент связывается. Если антиген не встречается со специфическим антителом, реакция не происходит, и комплемент остается несвязанным. Когда реакция завершается, присутствие или отсутствие комплемента в опытной системе определяют в отдельном эксперименте, используя гемолитическую систему.

2. Гемолитическая система. Она состоит из суспензии эритроцитов барана в смеси с гемолитической сывороткой, которая сенсибилизирована в результате предварительной инкубации при 37 C в течение 30 минут. Гемолитическую систему добавляют к опытной системе инкубируют также при 37 C в течение 30 минут. Если антиген соединился со специфическим антителом, комплемент связывается и не участвует в гемолизе - эритроциты остаются неповрежденными, РСК положительна. Если же антиген не соединился со специфическим антителом, комплемент остается свободным, и может происходить гемолиз: суспензия эритроцитов просветляется с выходом гемоглобина в раствор, результат РСК отрицателен.

РСК широко используется для обнаружения антител при заболеваниях, вызванных риккетсиями, хламидиями, микоплазмами, вирусами, простейшими и гельминтами. РСК широко используется в диагностике сифилиса (реакция Вассермана).

7.5. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

В реакции иммунофлюоресценции используются молекулы антитела, меченые флюоресцентным красителем типа изотиоцианата флюоресцеина, чтобы обнаружить антиген. Например, она используется для быстрой идентификации неизвестного инфекционного агента в исследуемом материале, в котором, чаще всего находится смесь микроорганизмов. Мазки, содержащие бактерии, вирусы, и т.д. исследуют под люминесцентным микроскопом и участки, где антитело присоединилось к антигену, могут быть обнаружены по их флюоресценции. Флюоресцеин дает желто-зеленую флюоресценцию. Флюоресцентная краска может быть присоединена к антителам, они тогда называются мечеными, или флюоресцирующими (люминесцирующи-

ми) антителами.

В реакции прямой флюоресценции антитела (рис.4) флюоресцентная краска непосредственно коньюгирована с антителами, специфичными к антигену. Культура микроорганизмов (или исследуемый материал), фиксированные на предметном стекле с помощью высокой температуры или спирта, обрабатывается раствором специфического люминесцирующего антитела, и молекулы антитела могут взаимодействовать с антигенами на поверхности клеток. После промывания мазка от несвязавшихся антител его микроскопируют в люминесцентном микроскопе. Будут видны только те микроорганизмы, которые прореагировали с мечеными антителами специфически.

Рис. 4. Прямая реакция иммунофлюоресценции

Антигены часто могут быть обнаружены более просто с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции. Исследуемый материал вначале соединяют с немечеными специфическими антителами (глобулинами) сыворотки крови определенного вида животных.

Локализацию этих антител затем устанавливают с помощью меченой флюоресцеином антиглобулиновой сыворотки. Например, меченая сыворотка против глобулинов человека, полученная путем иммунизации кролика человеческим глобулином, может быть использована для обнаружения человеческих антител. Эта реакция более чувствительна и более широко используется, чем прямая РИФ.